肺癌作为一种恶性肿瘤严重威胁着人类健康和生命。放疗是治疗肺癌的一种重要手段,而辐射抵抗能严重影响放疗疗效。如何提高肿瘤细胞对放疗的敏感性,降低对放疗产生的抵抗是目前放疗治疗面临的重大问题。TRIB2与肺癌发生发展密切相关,为了研究TRIB2在肺癌辐射抵抗中的作用及其相关信号因子,我们开展本课题研究。研究分两部分:一、TRIB2、NF-κB(P65)与Smad3在肺腺癌及癌旁组织中的表达分析收集20例肺腺癌及相应癌旁组织,Western blot检测组织中TRIB2、NF-KB(P65)/p-NF-KB(p-P65)、Smad3/p-Smad3等的表达,结果显示在肺腺癌组织中 TRIB2、p-Smad3/Smad3 的表达上调,而 NF-κB(P65)/p-NF-κB(p-P65)的表达下调。从ONCOMINE数据库获得数据,进行Pearson相关性检验分析,结果表明TRIB2与Smad3表达呈正相关(P<0.05),TRIB2与NF-κB(P65)表达呈负相关关系(P<0.05)。二、TRIB2调节NF-κB相关信号在辐射抵抗肺腺癌细胞中的作用(一)TRIB2在辐射抵抗肺腺癌细胞中的表达检测辐射诱导建立辐射抵抗肺腺癌细胞株A549-34R与A549-40R,应用荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光检测TRIB2 mRNA及蛋白质的表达水平,发现TRIB2在辐射抵抗细胞株A549-34R、A549-40R中表达明显高于非辐射抵抗A549细胞。(二)TRIB2对辐射抵抗肺腺癌细胞增殖、凋亡与辐射敏感性的影响过表达或抑制TRIB2水平,采用MTT、Annexin V-FITC/PI双染与X射线照射的方法检测TRIB2对辐射抵抗A549-34R细胞增殖、凋亡与辐射敏感性的影响。结果显示,过表达TRIB2能明显促进细胞的增殖并抑制细胞凋亡;而干扰TRIB2的表达能抑制细胞的增殖、促进其凋亡并增强细胞辐射敏感性。(三)TRIB2调控NF-κB相关信号因子的表达Western blot 检测在 A549、A549-34R 及 A549-40R 细胞中 NF-κB (P65)/p-NF-KB(p-P65)、TNF-α、IFN-γ、IL-10 的表达,结果显示上述蛋白在 A549-34R及A549-40R细胞中明显减少,IL-10的表达变化不明显。在辐射抵抗肺腺癌细胞中过表达 TRIB2 后,NF-κB (P65)、p-NF-κκB(p-P65)、TNF-α、IFN-γ 的表达会下调。应用 siRNA 抑制 TRIB2 表达,则 NF-κB (P65)、p-NF-κκB(p-P65)、TNF-α、IFN-y表达均上调。采用p-NF-KB(p-P65)荧光素酶报告基因反应系统检测TRIB2是否能够调控p-NF-κB (p-P65)的启动子活性,发现过表达TRIB2后p-NF-KB(p-P65)的启动子活性水平降低,siRNA抑制其表达后则相反。(四)TRIB2调控NF-κB相关信号分子的可能机制首先,IP检测TRIB2是否直接与NF-κB (P65)相互结合,结果未发现二者存在相互作用。我们推测TRIB2可能与IκκB-α相互作用,影响NF-κB (P65)的活性,通过Western blot检测p-IκκB-α、IκB-α在A549细胞中与辐射抵抗肺腺癌细胞中的表达,结果显示与非辐射抵抗细胞组相比辐射抵抗细胞p-IκB-α的表达下调,IκB-α的表达则上调。将TRIB2过表达载体转染到辐射抵抗肺腺癌细胞中,则发现p-IκB-α的表达水平下调,IκB-α的表达上调。用siRNAs抑制TRIB2表达,发现p-IκB-α表达明显增高;但通过免疫共沉淀实验未发现TRIB2与IκκB-α直接结合。其次,我们依次探讨了 TRIB2是否与β-Trcp、IKK、p100直接结合,影响NF-κB (P65)的活性。结果发现TRIB2未与β-Trcp、IKK结合,而与p100直接结合,进而抑制了 NF-κB (P65)的活性。结论1.在肺癌组织中,TRIB2与smad3表达呈正相关,而与NF-κB (P65)表达呈负相关。2.干扰TRIB2的表达能够抑制辐射抵抗肺腺癌细胞的增殖、促进其凋亡并增强其辐射敏感性,具体机理可能与负性调节NF-κB (P65)及TNF-α、IFN-γ表达相关。3.在辐射抵抗肺腺癌细胞中,TRIB2可能是通过与p100直接结合,进而负调控NF-κB相关信号因子的表达。