纳米孔作为一种单分子传感器件受到越来越广泛的关注,其在单分子水平上检测和分析酶促反应具有免标记、样品消耗量低、简便快速等独特优势。当前,应用纳米孔或纳米通道检测酶反应主要集中在两种检测方法上:一种为采用生物纳米孔对酶反应进行检测,主要为通过酶分子或相应反应产物与生物纳米孔的相互作用间接的检测酶反应的发生;另一种检测方法为应用锥形纳米通道的整流效应,通过检测酶反应前后锥形纳米通道整流效应的变化,实现对酶反应的检测。尽管以上研究采用了纳米孔或纳米通道实现了对酶反应的检测,但由于生物纳米孔存在稳定性差,溶液条件耐受度低以及尺寸无法调整等缺陷,使得其在检测酶反应研究方向上受到了极大的限制。而采用锥形纳米通道检测酶反应主要依靠其整流效应,对酶分子的选择有一定的要求,并需要繁琐的化学修饰过程,使得其难以广泛应用。因此,提出一种高效稳定的单分子纳米孔酶反应检测方法至关重要。本课题采用氮化硅纳米孔实现对单分子酶反应的检测及其结合核酸纳米结构进行单分子酶反应检测方法研究。本课题提出的固态纳米孔单分子酶反应检测方法为单分子检测研究提供一种新的手段,并对相应的酶反应临床医学诊断提供新的思路。具体研究如下:（1）应用一种固态纳米孔限位空间内化学修饰的辣根过氧化物酶催化反应检测。首先,我们采用聚焦离子束（FIB）在厚度为100 nm的氮化硅悬空膜上加工了直径约为50 nm的纳米孔。在此基础上,采用碳二亚胺（EDC/NHS）化学交联方法将辣根过氧化物酶（HRP）修饰在纳米孔内壁。通过扫描电镜（SEM）及I-V曲线等表征手段验证辣根过氧化物酶在纳米孔内的修饰情况。成功修饰辣根过氧化物酶分子后,向纳米孔通道内加入反应底物2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）与过氧化氢（H2O2）溶液,在固定化的辣根过氧化物酶存在的情况下,生成产物ABTS自由基（ABTS·+）。反应产物ABTS·+会在纳米孔限位空间周围发生聚集并与带有负电荷的纳米孔内壁发生作用,聚集的ABTS·+会在静电力的作用下穿过纳米孔,并产生电流阻塞的易位（Tanslocation）事件。我们对不同电压下酶催化反应产物引起的电流变化事件特征值进行了分析,发现电流阻塞幅值（?I）随着电压的增加而增加,产物易位事件的持续时间（?t）与施加的电压呈指数衰减的关系（?te-v/v0）。在此基础上,我们对易位事件的电导变化以及典型的单个事件也进行了研究。最后,我们对酶催化产物易位事件引起的电导变化以及体积排阻进行了研究,从而实现对酶催化反应活性进行了实时检测。（2）在上述基础上,我们提出了一种结合DNA纳米结构的酶分子孔内组装及酶的催化活性测试。由于采用上述的检测方法得到的为大量酶分子统计意义上的催化作用,同时存在酶失活的现象。为了克服以上研究的缺陷,开展了一种结合DNA纳米结构的固态纳米孔限位空间内酶分子组装的新方法的研究,并在该方法的基础上测试了酶催化反应。我们首先设计并合成不同尺寸及形状的DNA纳米结构（DNA四面体与DNA多面体）。通过对合成产物尺寸均一性的比较,我们最终采用DNA四面体结构。该DNA四面体结构的边长约为9 nm,顶点处分别带有设计序列的DNA单链。我们通过化学修饰方法将设计序列的短链DNA探针修饰在直径约为40 nm的氮化硅纳米孔的内壁上,该探针能够与DNA四面体结构的其中三条DNA单链杂交。而DNA四面体结构的剩余的一个顶点处的DNA单链不能与孔壁修饰的探针杂交。该第四条DNA单链在末端处修饰有生物素,能够与结合有链霉亲和素的单个辣根过氧化物酶分子连接,从而该链顶端处能够连接单个辣根过氧化物酶分子。由于纳米孔限位空间有限,因此通过该方法,能够将有限个辣根过氧化物酶分子组装在氮化硅纳米孔限位空间内。通过扫描电镜（SEM）及I-V曲线等表征手段进行了验证。成功组装后,我们将反应底物ABTS与过氧化氢H2O2加入到限位空间内,通过对反应产物易位事件的特征值:电流变化（?I）与变化的持续时间（?t）的分析,以及对易位分子引起的电导变化（?G）的研究实现对辣根过氧化物酶分子的催化反应的实时检测。通过该方法能够实现对组装在限位空间内的数个酶分子催化反应的检测。本章首次将纳米孔传感器与DNA纳米结构结合,由于DNA纳米结构的可设计性,因此,通过该方法能够将特定数量的生物分子组装在纳米孔内,为单分子检测及分子构象研究提供了新的思路。（3）基于前面合成的DNA四面体结构的基础,为了验证DNA四面体结构的有效性,提出了一种新型的基于DNA四面体结构的固态纳米孔检测GR-5脱氧核酶裂解反应的方法。由于GR-5脱氧核酶约为30个碱基长度的DNA单链,无法采用直径较大的固态纳米孔对其进行直接检测。因此,本文首先设计并合成了边长为9 nm的DNA四面体结构,并将其与DNA脱氧核酶及其互补的底物形成的双链结合形成复合物（TBD complex）。在此基础上,我们首先采用直径约为40 nm的氮化硅纳米孔对复合物进行检测,同时,加入激活离子（Pb2+）催化GR-5裂解其底物,并采用相同的纳米孔对其裂解后的产物进行检测。因此,通过检测与区分该复合物易位信号与脱氧核酶裂解底物后的易位信号的差异实现对GR-5裂解反应的检测。为了验证该方法的有效性,我们采用了更大直径的固态纳米孔（约60 nm）进行测试,通过检测与分析,证明该方法依然能够完成对GR-5酶裂解反应的检测。最后,我们对两种直径纳米孔的检测事件进行了对比分析。本方法能够提高固态纳米孔对小分子的检测能力,有效的拓展了大直径纳米孔的检测应用范围。（4）为了将单个分子组装在纳米孔限位空间内,我们尝试结合控孔DNA纳米板结构组装DNA单链,并探索该组装方法。我们首先合成了DNA纳米板结构。该结构的外部尺寸为60×54 nm,厚度约4.4 nm（双层DNA双螺旋）并具有一个尺寸为15×14 nm矩形中心孔。为了采用该DNA纳米板结构将单个生物分子组装在孔内,我们采用了三种直径（30 nm,23 nm,17 nm）的氮化硅纳米孔进行了测试。我们分别对DNA纳米板停驻（Docked）在三种直径纳米孔上后的电流基线的稳定性及电压承受能力进行了验证。发现当DNA纳米板停驻在30 nm与23 nm直径纳米孔上后,当电压超过200 m V时,DNA纳米板会发生变形,并能够在电场力的作用下穿过纳米孔。然而,当DNA纳米板停驻在17 nm直径纳米孔上后,能够承受较大的电压,直到电压达到700 m V时,纳米板才会发生变形及易位行为。在此基础上,通过对合成DNA纳米板的装订（Staple）链的设计,我们将DNA纳米板结构延伸出一条DNA短链（Poly T40）。并通过纳米板结构将Poly T40组装在20 nm直径的纳米孔限位空间内。通过施加电压,在300 m V与400 m V下,DNA纳米板能够停驻在纳米孔上,并其在停驻后出现新的电流变化事件。通过分析,我们发现在该直径（20 nm）纳米孔下,DNA纳米板停驻后引起的电流降约为6 n A~8 n A。我们对纳米板停驻后新的电流变化事件进行了分析,其电流变化值（?I）小于2 n A,电流变化的时间（?t）小于0.5 ms。虽然,由于DNA纳米板停驻后产生较大的噪声信号,并且DNA纳米板存在电流泄漏现象,目前我们无法验证该事件完全是由Poly T40的构象变化引起的,但是,通过该方法我们实现了在固态纳米孔限位空间内组装DNA单链分子,并得到其在电场力作用下引起的电流变化信号。最后,我们采用有限元仿真对DNA纳米板停驻在不同直径纳米孔前后的电势变化进行了分析,发现当DNA纳米板停驻在纳米孔处后,会在纳米孔口处产生较大的负电势。为了验证该负电势对分析物过孔行为的影响,我们实验验证了M13mp18环状DNA在纳米板停驻前后的纳米孔中的过孔事件,发现DNA纳米板停驻后,由于负电势的存在,会大大降低负电性的DNA过孔速度,减慢接近一个数量级。因此,该方法为纳米孔单分子检测中易位速度过快问题的解决提供了新的思路。