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研究背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染持续6个月称为HBV慢性感染。研究表明，无论是否是临床上可检测的到的慢性肝炎，也无论其是否引起肝脏的损害，这种HBsAg的携带状态导致肝细胞癌(HCC)发生的危险性明显增加。尽管在许多的国家乙型肝炎疫苗已被成功的应用于HBV的防治，但是对于众多已经感染HBV患者来说，建立一种有效的检测程序有选择性的对病毒感染的严重阶段进行诊治是很重要的，本实验所研究的HBV转录体正是这样的一个潜在的有价值的检测指标。 HBV DNA有4个重叠的开放式阅读框架(Open Reading Frame，ORFs)，即：PreC／C、多聚酶、PreS 1／PreS2／S和X基因，其可被转录到基因组和前基因组RNA分子中。其中最小的病毒转录体HBx翻译产物被认为是肝癌的致癌因子，HBx的特性包括，刺激转录和信号转导、干扰DNA修复、诱导凋亡、促进体内体外的恶性转化。在HBV复制期间，在HBx-ORFs产生两种病毒转录体，即：全长型转录体(Full-length RNA，fRNA)Poly(A)信号成熟位于(1789位)UAUAAA结构区，和顿挫型转录体(Truncated RNA，trRNA)，成熟 第四军医大学博士学位论文亩亩亩百面面面百面面面面面面曰面面面面面面亩面面面面面面面面面面的Poly(A)信号位于(1 661位)CAUAAA结构区。后者隐藏于HBx基因ORFs内，只有当仅NA成熟信号被灭活时，trRNA成熟信号才具有活性。 目的:1996年Schutz等建立用于检测肝组织内HBV全长型和顿挫型转录体的方法;此后，Su和Zhang等于2001年建立了从血清中检测这两种转录体的方法。本研究采用上述两种研究方法，分别选择HBsAg阴性和HBsAg阳性的肝癌、肝硬变、其他肝病患者及非肝病患者，以及其中部分手术治疗患者，收集其血清标本和手术切除的肝组织标本，提取核酸后经PCR检测其中XDNA、fRNA和trRNA，分析其产物与终末期肝病的关系。并首次对来源于同一患者的血清标本和肝组织标本中的病毒转录体进行对照研究，进一步阐明HBV转录体存在的意义。 方法:实验一:病例选取我校唐都医院和西京医院普通外科2002/12一2003/08住院病人145(男102，女43)例，年龄8一73(平均46.85)岁;肝癌67例，肝硬化46例，其他肝病患者19例，非肝病患者13例。145例中HBsAg阳性者70例，其中HBsAg阳性/HBeAg阳性20例:HBsAg阴性者75例，其中HBV免疫学完全阴性32例。 血清标本收集:抽取患者静脉血sml，置于灭菌干燥无抗凝特制离心管内，取血后迅速于低温离心机4’C，30009，离心25min，吸取上层血清并分装。一70 OC保存备用。 血清核酸提取及pCR:采用High pure viral nueleie aeid kit提取血清核酸，终产物为SOul。以此核酸提取物为模板，txs十和txas一为引物，经pCR扩增HBx DNA。应用Titan One Tube RT一PCR System，txs+/txSZ+和txass一为引物，经一步法扩增fRNA和trRNA。PCR产物经琼脂糖电泳显示结果。 实验二:选取实验一中部分手术患者49(男32，女17)例，年龄8一62(平均46.27)岁;其中肝癌16例，肝硬化25例，肝良性瘤 4 第四军医大学博士学位论文;二二奋奋亩亩亩亩亩亩百亩亩亩亩亩亩亩奋亩亩亩石百面面面面面亩亩亩亩亩亩亩亩百4例，其他4例，49例中HBsAg阳性27例，其中HBsAg阳性/HBeAg阳性5例;HBsAg阴性22例，包括HBV血清学标志物完全阴性者12例。 肝组织标本处理:肝组织标本手术切除后，立即置于液氮运输，一70℃冰箱保存。组织核酸提取采用TRIzol试剂，分别提取出DNA终产物300ul，RNA终产物50ul。 PCR及RT一PCR:以DNA提取物为模板，txs+和txas一为引物，扩增HBx DNA。RNA提取物经过DNA酶处理后，然后采用两步法，RNA反转录成。DNA，再以cDNA为模板，txs+/txsZ+和txass一为引物，经两轮PCR扩增限NA和trRNA。PCR产物经琼脂糖电泳显示结果并与血清中结果进行对照分析。 所有PCR及RT一PCR产物经琼脂糖电泳显示结果后，进行Southern一bolt印迹杂交。包括PCR扩增产物DNA从琼脂糖凝胶上转印到Hybond一N+膜上，用标一记的Dig探针抗体进行杂交，以验证PCR扩增的特异性。 结果:实验一:70例HBsAg阳性的患者血清中，HBx DNA和病毒转录体的总检出率为60例(85.7%);其中检出HBx DNA和RNA均为阳性者43例(61.4%);限NA在HBsAg阳性/HBeAg阳性血清中的检出率明显高于HBeAg阴性的其他患者血清中的检出率 (p<。.05)。HBx DNA和病毒转录体在HBsAg阳性患者血清中检出率高于HBsAg阴性的患者血清中的检出率(p<0.05)。 75例HBsAg阴性的患者血清中，HBx DNA和病毒转录体的总检出率为46例(57.3%);其中trRNA在HBsAg阴性的隐匿性感染患者血清中有较高的检出率44.0%。HBsAg阴性的终末期肝病患者(肝癌，肝硬化)血清中HBV转录体的检出率明显高于其他肝病患者血清中的检出率;在13例非肝病患者的血清中，HBx DNA和fRNA检出结果为0，而仅有1例患者血清中检出trRNA。 HBsAg阳性的患者血清中ALT和AsT与HBsAg阴性患者统计无