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本研究构建了原核表达载体pET32a-hCD80/anti-CD19scFv,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中经IPTG诱导表达了基因工程蛋白hCD80/anti-CD19scFv(双功能蛋白抗CD19/B7)。所表达蛋白为N端含有His tag和Trx TagTM标签的可溶性蛋白,产量较前期研究的表达系统显著提高。初步纯化产物经过肠激酶切除其N端的His tag标签和Trx TagTM融合蛋白序列,经二次纯化后,得到不带His tag的hCD80/anti-CD19基因工程蛋白。ELISA实验表明工程蛋白保留了其特异性的CD19抗原结合活性。体外功能实验表明,CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病患者的原代肿瘤细胞,在体外经双功能蛋白抗CD19/B7修饰后,可诱导化疗缓解后的自体淋巴细胞活化,继而特异性杀伤自体肿瘤细胞。本研究进一步通过高密度发酵获得了大量可溶性基因工程蛋白,采用125Ⅰ标记法研究了双功能蛋白抗CD19/B7在KM小鼠体内代谢及组织分布。结果表明,经尾静脉给药,双功能蛋白抗CD19/B7在KM小鼠体内药代动力学行为符合二室模型,组织分布时间为19.2±10min,血浆消除相半衰期为11.6±0.7h。双功能蛋白抗CD19/B7在小鼠的肝、脾、肺、肾等组织分布浓度较高,主要通过肾脏代谢。本中试实验为进一步研究奠定了基础。多种白血病相关蛋白及造血相关调节因子受泛素-蛋白酶体途径的调节(ubiquitin-proteasome pathway),或通过调节该途径的功能参与细胞生物学调控。探索白血病或造血相关因子在蛋白内的泛素化修饰与稳定性,研究其影响因素,不仅可以进一步阐明造血系统疾病的发生机制,还可探寻新的疾病治疗靶点。已有研究报道NPM1及AML1-ETO均可被泛素化修饰,通过泛素-蛋白酶体途径发生降解,目前尚无逆向调节这些分子泛素水平的相关去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes, DUBs)报道。为此,本研究应用双荧光报告系统偶联shRNA干扰技术,探索去泛素化酶家族基因对NPM1cA(胞浆型NPM1突变体A)及AML1-ETO的调节作用。本研究构建了新的pCMV-DsRed-IRES-EGF-MCS双荧光报告载体,并将NPM1、NPM1cA及AML1-ETO开放读码框序列克隆到该报告载体MCS多克隆酶切位点。我们通过上述三种报告载体,在293T细胞中分别表达了这三种蛋白,观察了它们的在293T细胞中的定位；应用流式细胞仪检测手段检测到三种蛋白在293T细胞的高稳定性,且定位于核仁的野生型NPM1比定位与胞浆的NPM1c稳定。综上,本研究初步建立了双荧光报告系统偶联shRNA干扰技术平台,初步探索了去泛素化酶家族基因对NPM1cA及AML1-ETO的调节作用,表明该检测体系和筛选方法有效可行。