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【研究背景】近年来,肺癌的发病率、死亡率呈逐年上升趋势,是目前恶性肿瘤死亡的首要原因[1]。肺癌的传统治疗方法主要有手术、放疗、化疗等,虽然这些疗法在临床治疗中带来了显著的疗效,但同时也产生了极大的副作用,增加患者痛苦,降低患者生存质量[2,3]。与传统治疗方法相比,分子靶向治疗具有高选择性和低毒性,在延长患者生存时间的同时改善生活质量。肿瘤分子靶向治疗是指在肿瘤分子细胞生物学的基础上,利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性(或相对特异的)结构分子作为靶点,使用能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一类疗法[4,5]。已知表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是目前肺癌治疗的主要分子靶点之一,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine-kinase inhibitor,TKIs)应用于临床EGFR突变的非小细胞肺癌治疗取得了显著的疗效[6,7]。而生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,Grb2)作为EGFR的衔接蛋白在信号传导过程中发挥了重要作用[8,9]。已有实验表明α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)在抑制多种肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡等方面具有重要作用[10,11]。本课题发现α-LA抑制A549细胞增殖,对α-LA处理A549细胞前后转录组水平差异进行分析,发现EGFR通路的衔接蛋白Grb2的m RNA表达水平显著下降。Grb2可能参与了α-LA抑制的非小细胞肺癌细胞增殖,我们在此基础上做了进一步的研究。【研究目的】探讨α-LA对非小细胞肺癌细胞的生物学作用及其分子机制。【研究方法】1.分别取1.0m M和2.0m M浓度的α-LA,检测时间点为0h、24h、48h、72h、96h、120h,采用CCK-8试剂盒检测对A549和NCI-H1975细胞增殖的影响,确定给药浓度。2.采用RNA-Seq技术对2.0m Mα-LA处理的A549细胞进行转录组差异基因表达分析。3.RT-PCR、Western blot检测2.0m Mα-LA处理A549和NCI-H1975细胞后24h内Grb2 m RNA水平和蛋白表达水平的变化,确定药物处理时间。4.沉默或过表达Grb2,采用Western blot验证转染效果,再采用CCK-8法分别检测A549和NCI-H1975两株细胞增殖的变化。5.50ng/m L EGF激活EGFR-ERK通路,Western blot检测通路激活前后2.0m Mα-LA对A549和NCI-H1975细胞EGFR和ERK蛋白表达水平的影响。6.沉默和过表达Grb2,Western blot分别检测EGFR和ERK蛋白在A549和NCI-H1975细胞中的表达水平;沉默Grb2后,50ng/m L EGF激活EGFR-ERK通路,Western blot检测EGFR和ERK蛋白在上述两种细胞中的表达水平。7.沉默或过表达Grb2,Western blot检测2.0m Mα-LA处理A549和NCI-H1975细胞后EGFR和ERK蛋白表达水平。【实验结果】1.1.0m M和2.0m Mα-LA均可抑制A549和NCI-H1975细胞增殖。2.2.0m Mα-LA处理A549细胞后,转录组差异基因表达显示,Grb2m RNA水平显著降低。3.2.0m Mα-LA处理A549和NCI-H1975细胞后Grb2m RNA水平和蛋白水平在12h和24h均下降。4.沉默Grb2抑制A549和NCI-H1975细胞增殖,过表达Grb2后A549和NCI-H1975细胞增殖无明显改变。5.2.0m Mα-LA处理A549和NCI-H1975细胞后引起p-EGFR和p-ERK蛋白水平下降,EGFR和ERK总蛋白水平无变化;2.0m Mα-LA抑制50ng/m L EGF诱导的p-EGFR和p-ERK蛋白水平上调。6.沉默Grb2后,A549和NCI-H1975细胞中p-EGFR蛋白水平下降,p-ERK蛋白水平无明显变化;沉默Grb2后降低了EGF诱导的p-EGFR和p-ERK蛋白水平,EGFR和ERK总蛋白水平无变化。7.沉默Grb2,2.0m Mα-LA处理A549和NCI-H1975细胞,p-EGFR和p-ERK蛋白水平降低;过表达Grb2,2.0m Mα-LA处理A549和NCI-H1975细胞,p-EGFR和p-ERK蛋白水平无明显变化。【研究结论】1.2.0m Mα-LA对A549和NCI-H1975细胞的增殖抑制开始于24h,A549细胞增殖抑制逐渐显著直到120h检测结束;NCI-H1975细胞增殖抑制在96h最明显。2.2.0m Mα-LA降低A549和NCI-H1975细胞Grb2的m RNA水平和蛋白水平。3.2.0m Mα-LA抑制A549和NCI-H1975细胞EGFR-ERK通路中EGFR和ERK蛋白磷酸化。4.沉默Grb2,A549和NCI-H1975细胞中p-EGFR蛋白水平降低,p-ERK蛋白水平无明显变化。综上所述,Grb2-EGFR介导α-硫辛酸抑制非小细胞肺癌细胞增殖。