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背景与目的:肿瘤转移,作为恶性肿瘤的重要生物学特征之一,是一个复杂的多步骤过程,包括肿瘤细胞脱离原发灶,浸润周围组织,进入到循环系统中,逃避免疫监督,游出脉管系统、定植到靶器官并不断增殖而形成转移灶等。在这一过程中肿瘤细胞的迁移能力几乎贯穿于肿瘤转移的各个过程,是肿瘤转移的限速步骤。迁移又分为定向迁移和非定向迁移。定向迁移,即趋化运动,在肿瘤细胞的转移和侵袭中起重要作用。人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER2),是表皮生长受体家族成员之一,HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌,易进展、侵袭性强,预后差。但靶向治疗药物曲妥珠单抗的应用显著提高了患者的总生存时间及无病生存时间。此外,HER2阳性亦发生于10-30%的胃癌中,HER2过表达在胃癌细胞中也被观察到与转移表型密切相关。尽管HER2过表达在胃癌患者亦可从曲妥珠单抗中获益,但其反应率仅约乳腺癌患者的一半,这可能与胃癌的异质性及其特殊的分子基因谱及调节网络有关,因此研究HER2阳性胃癌的转移机制将有助于为抗肿瘤新药的研发提供思路。JWA,作为一种微管相关蛋白(MAP),通过直接与微管蛋白结合来调节其动力稳定性,参与细胞凋亡过程。此外,最近的研究表明,JWA可能作为一种抑癌基因,影响转移的多个步骤。在黑色素瘤中,干涉JWA后,肿瘤细胞的迁移、粘附、侵袭、新生血管生成都显著增强。此外,之前研究证实,JWA参与三氧化二砷(As2O3)和佛波酯(PMA)对宫颈癌细胞迁移及细胞骨架的调节。然而,JWA对肿瘤细胞迁移行为的生物学作用、机制及其临床应用价值未完全阐明,尤其是HER2阳性胃癌中暂无人报道。本研究旨在将JWA与EGF诱导的肿瘤细胞趋化运动相关联,探讨其对胃癌细胞迁移能力的影响,初步明确JWA在HER2阳性胃癌细胞趋化运动中的作用机制。同时研究JWA对HER2阳性胃癌患者的临床价值。方法:本研究选用NCI-N87及HGC-27细胞作为HER2阳性的胃癌细胞模型,分别过表达和干涉JWA表达,结合多种分子生物学手段,具体方法如下:1.用EGF诱导的趋化运动实验检测JWA高、低表达对胃癌细胞的运动能力影响。用鬼笔环肽-FITC染色后进行免疫荧光实验,检测EGF刺激后JWA对纤维状肌动蛋白(F-actin)分布及聚合的影响。2.采用Ed U实验检测JWA表达对细胞增殖能力的影响。3.实时定量PCR及Western Blotting方法检测JWA对HER2、EGFR和ERBB3总蛋白和磷酸化蛋白、m RNA水平的影响。采用Western Blotting检测HER2下游的PI3K/AKT信号及MEK/ERK信号的活化程度,用磷酸化抗体采用磷酸化PAK抗体及G-LISA实验检测控制细胞运动的关键激酶Rac1/Cdc42与PAK1的激活。采用HER2低表达质粒及特异性抑制剂回复HER2水平后,采用Transwell、免疫荧光实验、G-LISA实验、Western Blotting方法检测HER2蛋白及其下游通路、细胞迁移能力的改变。4.实时定量PCR检测JWA缺失细胞中HER2上游转录因子m RNA水平的改变。采用Western Blotting、浆核分离方法验证JWA缺失或多表达后PEA3总蛋白及核蛋白水平的改变。荧光素酶报告基因实验及凝胶迁移阻滞实验(EMSA)检测JWA对PEA3与HER2启动子的结合能力及HER2启动子转录活性的调节作用。用si RNA沉默PEA3后采用Western Blotting、Transwell、G-LISA实验验证PEA3在JWA介导的HER2调节及迁移抑制中的作用。5.用荧光素酶报告基因实验及Western Blotting实验结合MEK抑制剂及PI3K抑制剂检测JWA调节PEA3活化的机制。6.在HER2阴性BGC-823细胞中Western Blotting、Transwell方法检测JWA是否抑制EGF诱导的细胞迁移及HER2、PEA3表达。7.在10对新鲜胃癌及癌旁组织中Western Blotting方法检测JWA与HER2的相关性。8.利用由128例晚期胃癌患者组成的组织芯片进行免疫组化,进一步明确JWA与HER2表达的相关性、两者与临床病理特征的关系及其临床预后意义。结果:本研究通过证实了:1.JWA抑制EGF诱导的细胞迁移和肌动蛋白细胞骨架重排。当过表达JWA时,EGF诱导的细胞迁移作用明显减弱,肌动蛋白细胞骨架重排减弱,板状伪足及丝状伪足的伸展受限,但在无EGF作为趋化因子时,JWA对迁移的抑制作用并不明显。2.Ed U实验显示JWA对增殖作用不显著。排除了增殖对迁移能力的影响。3.JWA对EGF诱导的细胞迁移的抑制作用依赖于JWA对HER2表达的抑制及其下游的PI3K/AKT信号的调节,从而减弱Rac1/Cdc42与PAK1的激活,影响细胞运动。但对EGFR和ERBB3无明显调节作用。4.HER2负性转录因子PEA3的激活是JWA介导的HER2下调所必须分子。与载体对照组相比,过表达JWA组细胞HER2的转录因子PEA3 m RNA水平上调,核内蛋白水平增加,PEA3与HER2近端启动子的结合能力增强,HER2启动子的活性显著减弱,但突变PEA3与HER2近端启动子的结合位点后,HER2启动子的活性虽明显减弱,但过表达JWA对HER2启动子活性无明显影响。在过表达JWA的细胞中沉默PEA3后,可部分回复JWA所致的迁移抑制作用及几乎完全恢复HER2蛋白的下调。5.JWA调控的PEA3/HER2需要ERK活化。JWA可激活MEK/ERK通路,从而维持PEA3蛋白表达,并活化其功能。使用MEK抑制剂处理过表达JWA的细胞后,可显著阻碍PEA3的表达,部分回复JWA抑制的HER2启动子活性。MEK抑制剂处理细胞,AKT磷酸化水平增强,但JWA过表达可部分减弱这种增强效应;而PI3K抑制剂明显减弱ERK磷酸化。这表明,JWA可依赖或不依赖PEA3/HER2来调节细胞运动。6.在HER2阴性BGC-823细胞中,JWA不影响HER2表达。尽管JWA仍然影响其迁移能力,但是JWA对HER2表达和活化的影响很小。但是当外源性过表达HER2后,过表达JWA组的HER2蛋白水平较对照组明显降低,其抑制的程度随外源性HER2表达水平升高而增加,表明JWA对HER2的调节是细胞特异的,它可能依赖于细胞HER2的水平。7.10对新鲜胃癌及癌旁组织中Western Blotting方法检测JWA与HER2显示出负相关关系。8.由128例晚期胃癌患者组成的组织芯片中,HER2和JWA蛋白表达之间显示出明显负相关性关系。JWA和HER2的表达都与组织学类型、淋巴结转移、肝脏转移有关。JWA低表达是晚期胃癌一个独立的不良预后因素,但在研究的总人群中HER2过表达不是一个独立预测因子。根据JWA和HER2的染色得分,患者可分为3组:两者均高或均低表达,JWA高且HER2低表达,低JWA且高HER2,患者JWA低表达且HER2高表达表现出比其它两组更差的预后。调整其他危险因素后,JWA和HER2的组合仍然是晚期胃癌一个强有力的预后标志。当用JWA表达水平(JWA低表达或高表达)分层,对于JWA低表达组,HER2高表达的患者较HER2低表达的患者表现出显著更短的生存时间。但在JWA高表达的患者中,HER2阳性和阴性组的生存时间间未见统计学差异。结论:综上所述,JWA可通过介导MEK/ERK/PEA3信号的激活,下调HER2的表达,调节HER2阳性胃癌细胞的运动。此外,JWA也可作为晚期胃癌一个有用的预后标记物,帮助分层HER2阳性患者的亚组,以便更好地识别不利的预后,及时予以个体化治疗。这项研究阐明了一个新的HER2上游调控因子JWA及其与HER2所致的迁移行为的关系,并初步探索了JWA调节HER2的分子机制,发现了JWA在HER2阳性患者的晚期胃癌中的预后价值,为抗转移药物提供新的靶点和新的预测因子。