背景和目的血小板活化(Platelet Activation)发生在各种缺血性心脑血管疾病、有血栓形成倾向疾病、免疫系统以及代谢性疾病当中。其中血小板活化、血栓形成或栓塞是导致心肌梗塞、脑卒中等心、脑血管事件的最后关键环节,是突发致死和致残的直接原因,其死亡人数已占到全球总死亡人数的一半以上,远超过肿瘤、传染病等其它疾病所造成的死亡。另外,据统计,约70%的致命性心脑血管疾病是由动脉粥样硬化易损斑块破裂、血小板活化及急性血栓栓塞所致。由此可见,血小板活化与动脉粥样硬化易损斑块在心脑血管急性事件的发生中起着关键性作用,而且血小板活化始终贯穿于动脉粥样硬化斑块发生、发展的全过程,其不仅能促进血栓形成,还是炎症与动脉粥样硬化的重要关联体,活化后可释放促炎症因子,诱导炎症反应并促进内皮细胞活化、变性,形成凝血-炎症网络,通过多层次多机制加剧斑块的发展、不稳定性／易损性和破裂,而斑块破裂与血小板活化、富血小板血栓之间形成恶性循环,共同促使栓塞事件的发生。因此,早期检测活化的血小板及其血栓将对恶性心脑血管事件的提前干预及早期治疗具有重要的临床意义,并可能为早期识别易损斑块提供新的思路。但是,目前临床上尚无早期诊断动脉血小板血栓的有效手段。随着靶向分子成像技术的新兴和发展,现有的许多无创影像手段,如：超声、MRI、CT、 SPECT等均在对血栓检测进行积极的分子水平探索。其中,靶向超声分子成像(Targeted Ultrasound Molecular Imaging)是将靶向病变组织特定分子的特异性配体连接于超声微泡表面,构建成靶向超声微泡,以其作为示踪剂,采用对比超声(Contrast-Enhanced Ultrasound, CEU)产生靶组织分子水平显影,从而实现疾病分子水平上特异性诊断的目的。与其他的传统影像技术相比,超声分子成像技术具有实时、高空间及时间分辨率、无放射污染、仪器便携和价廉等优点。目前,国际上已有研究者成功实现了动物静脉、微动脉血栓的靶向分子成像,而动脉血栓的靶向分子成像则尚未见有关报道。因血小板膜糖蛋白Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa)受体高度表达于活化的血小板表面,是血小板活化的一种标志,其可与纤维蛋白原等多种粘附蛋白的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)结合位点结合,是各种因素致血小板聚集和血栓形成的最终共同通路,故GPIIb/IIIa是血栓检测及临床抗凝治疗中一种重要的靶向分子。已有研究将RGD序列线性寡肽连接在超声微泡表面,通过配体-受体的作用与血栓中活化的血小板GPIIb/IIIa受体特异性结合,成功实现了深静脉、心房血栓的靶向超声分子成像。然而由于动脉内存在高剪切应力和“轴流”特性,实现动脉血栓的靶向分子显像则需要靶向结合能力更强的微泡。有研究表明,人工合成的RGD环寡肽序列能够模拟人体内源性RGD结合位点,比含RGD序列的线性寡肽具有更强的结合血小板GPIIb/IIIa受体的能力.目前,我们课题组已成功构建出携带环RGD寡肽的靶向超声微泡,实现了腹主动脉血栓的分子成像,但是该实验利用凝血酶所制备的血栓模型,如同目前实验研究中经常采用的Fecl3化学损伤内皮、机械损伤内皮等方法[28-30]建立的动物动脉血栓模型一样,形成的均为混合血栓。由于炎症的促凝作用以及凝血-炎症网络的相互作用所形成的恶性循环是血小板活化及血栓形成的重要发病机制,目前广泛认为动脉血栓形成发生的最早阶段,很大部分是由炎症介导的,而且最先激活血小板,形成富血小板血栓,故炎症主导的动物血小板血栓模型将在理论上更接近于人体临床早期动脉内的血小板活化及血栓形成。但是上述实验研究中所采用的血栓模型构建方法均未能接近体内早期动脉血栓形成的病理机制,因此,建立一种高度模拟体内炎症性动脉血小板血栓的动物模型将有利于动脉血栓、体内炎症性疾病的研究发展及其临床应用拓展。花生四烯酸(Arachidonic Acid, AA)作为广泛存在于体内的不饱和脂肪酸,可以通过多种途径产生类花生四烯酸生物活性物质,如前列腺素E2、前列环素、血栓烷素A2、白细胞三烯等,在炎症反应、血小板激活等方面具有重要的调节作用。目前,国内已有研究利用AA成功建立人体皮肤炎症模型,但国内尚未有体外利用AA模拟体内炎症、建立动脉血小板血栓模型的研究。因此,本研究将可与活化血小板高表达的GPIIb/IIIa受体特异、高效结合的RGD(Arg-Gly-Asp)环寡肽序列以共价连接的方式装配在普通脂质微泡上,制备出血栓靶向超声微泡(MBRGD),并体外利用花生四烯酸建立小鼠颈动脉血小板血栓模型；分别应用平行板流动腔评价靶泡与GPIIb/IIIa受体的亲和力及粘附能力、体内血小板荧光验证血小板血栓形成；继而,体内应用MBRGD和对比超声检查,对小鼠颈动脉血小板血栓进行靶向超声显像,旨在成功构建携RGD环寡肽序列靶向微泡和建立炎症性动脉血小板血栓模型,并探讨MBRGD结合CEU早期评价动脉内活化血小板及其血栓形成的可行性。方法1.超声微泡的制备及理化性质鉴定将各种相关脂质材料与人工合成的磷脂环五肽或分子量相当、结构相似的同型非特异性多肽按一定比例加入适量蒸馏水中水浴溶解后,通入全氟丙烷(C3F8)气体,剪切仪高速剪切至形成乳白色液体制备靶向超声脂质微泡(MBRGD)和同型对照非靶向微泡(MBCON),静置、洗涤、纯化3次。制备及纯化后的微泡均置于冰箱中4℃保存备用。显微镜下观察并采用库尔特计数仪检测其粒径大小及浓度。2.平行板流动腔体外评价超声微泡的靶向粘附效能2.1结合实验：平行板流动腔中的培养皿分为3组,包括血小板GPIIb/IIIa包被(1μg/ml)组、GPIIb/IIIa包被+大量RGDfv封闭组和空白对照组(每组均n=3), MBRGD和MBCON(约5×106/ml)经微量注射泵分别以0.5dyn/cm2、2.0dyn/cm2和4.0dyn/cm2的剪切应力通过平行板流动腔；自显微镜下观察到有微泡出现后开始连续录像6min,观察第6分钟时微泡的结合情况。2.2、解离实验：平行板流动腔以GPIIb/IIIa包被(1μg/ml),腔内注入每种微泡(约5×106/ml)0.2ml后静置5分钟,先以0.9%生理盐水以0.2dyn/cm2剪切应力冲洗掉静止但未结合的微泡,待镜下无游离的微泡后,每30s增加一次剪切应力,直至镜下微泡完全解离。20倍物镜在固定的视野下全程录像、拍照。3.小鼠颈动脉血小板血栓模型的制备及体内荧光验证分离20只昆明小鼠双侧颈动脉,以薄膜隔离颈动脉与周围组织,且不完全性结扎双侧颈动脉。随机在小鼠一侧颈动脉外膜上滴加6ul花生四烯酸(AA,250mg/mL),另一侧颈动脉均不予试剂处理,作为自身空白对照,AA作用时间为30min。通过心脏采血法分别取20只昆明小鼠的全血,0.129M枸橼酸钠抗凝后经离心法提取浓缩血小板并制备血小板混悬液20份。制备的血小板混悬液与钙黄绿素-AM (Calcein-AM,1000ng/mL)暗处孵育15min后,经尾静脉留置针随机分别注入小鼠体内。普通光学及荧光显微镜下观察孵育后血小板、动态观察并记录颈动脉内血小板血栓形成情况。4.靶向超声分子成像及图像分析动物模型制备后,将其均分为实验组(n=10)和封闭组(n=10),固定超声探头(15L8)于颈总动脉远心端,调整探头位置获得良好的双侧颈动脉横轴切面后保持位置不变,且仪器的各项参数在整个实验过程中不变；CEU检查采用二次谐波成像(Second Harmonic Imaging)技术进行,探头发射和接受频率分别为7.0和15MHz,机械指数(Mechanical Index, MI)为0.18,超声发射间隔时间设定为10s。MBRGD和MBCON (5×107个)经尾静脉弹丸式随机平均注入实验组或封闭组小鼠,其中封闭组小鼠在微泡注入前先经尾静脉给予18ug/g25依替巴肽以饱和GPⅡb/Ⅲa整合素受体,连续CEU观察6分钟并取图,后给予高机械指数(MI=1.9)连续脉冲破坏3s获得本底图像,所有图像均测量声强度(VideoIntensity, VI)并进行彩色编码处理。5.HE和免疫组化染色检查：图像采集结束后,取小鼠双侧颈动脉迅速做冰冻切片,分别行HE染色和免疫组化染色。结果1.超声微泡制备情况普通显微镜下观察MBRGD和MBCON均为分布均匀、大小形态一致的透亮微气泡,采用库尔特计数仪测得MBRGD粒径分布为2.23～2.40μm,浓度约为7.17-8.17×108个/ml；MBCON粒径分布为2.23～2.46μm,浓度约为7.05～8.58×108个/ml。两种微泡平均粒径和平均浓度比较均无显著性差异(P>0.05)。2.平行板流动腔法评价MBRGD的靶向粘附效能2.1、结合实验显示：在GPⅡb/Ⅲ包被组中,在相同剪切应力下,6min后MBRGD结合数目均明显高于MBCON (P＜O.05);在不同剪切应力下MBRGD与MBCON结合数目均随着剪切应力的逐渐增大(0.5-4.0dyn/cm2)而减少(P<0.05),但在高剪切应力条件下MBRGD仍有较多的结合数目；其中,当剪切应力为0.5dyn/cm2时,6min后可见粘附的MBRGD微泡数目有(182.00±26.21)个／视野,剪切应力为4.0dyn/cm2时,粘附的MBRGD数目为(37.67±11.24)个／视野。但是在封闭组和空白组中,在相同剪切应力下,6min后MBRGD结合数目与MBCON均无显著性差异(P>0.05),即便在剪切应力为0.5dyn/cm2时,MBRGD也几乎不能与平行板粘附另外,MBCON在各组中不同剪切应力下均不能与平行板流动腔良好结合,结合数目均较少。表明MBRGD与血小板GPⅡb/Ⅲa具有特异性靶向粘附效能。2.2、解离实验显示：随着剪切应力的不断增加,MBRGD结合于平行板流动腔表面的数目逐渐减少,其半数解离时剪切应力为26.09±2.93dyn/cm2,完全解离时剪切应力为98.28±2.86dyn/cm2;而MBCON半数解离时及完全解离时剪切应力仅有5.14±1.40dyn/cm2和30.02±3.34dyn/cm2,与MBRGD相比,均有显著性差异(P<0.05)。3.颈动脉血小板血栓体内荧光验证血小板混悬液与calcein-AM暗处孵育后,荧光显微镜下观察血小板呈现绿色荧光；经尾静脉注射入小鼠体内,荧光显微镜下观察AA作用侧颈动脉纵轴管腔显示：AA作用侧颈动脉管腔由无荧光物质聚集到逐渐有带绿色荧光的血小板聚集,证实AA作用侧颈动脉内有富血小板血栓形成。4.颈动脉血栓CEU检查结果及Ⅵ值分析分别随机经尾静脉弹丸式注射MBRGD和MBCON6分钟后,在实验组小鼠中,MBRGD在AA作用的颈动脉侧中可呈现较对侧明显的超声显影,而MBCON在双侧颈动脉中均未见明显超声显影；MBRGD和MBCON在假手术组小鼠双侧颈动脉中均未见明显超声显影。对比超声Ⅵ值分析：实验组中MBRGD和MBCON在颈动脉AA作用侧血栓Ⅵ值分别为21.24±3.67和3.30±1.51,前者是后者的6.43倍,两者之间有显著性差异(P<0.05),且MBRGD在AA作用侧的Ⅵ值高于对照侧(21.24±3.67vs.2.35±1.21,P<0.05),MBCON在实验组AA作用侧与对照侧Ⅵ值无显著性差异(P>0.05)；封闭组中MBNGD和MBCON双侧颈动脉侧Ⅵ值均无显著性差异(P>0.05)。5.HE及免疫组化结果实验组AA侧颈动脉内可见血小板小梁形成、并且表达大量的GPⅡb/Ⅲa受体,而封闭组AA侧颈动脉内虽可见血小板小梁形成,但GPⅡb/Ⅲa受体表达弱,对照侧颈动脉内无血小板小梁形成且不表达GPⅡb/Ⅲa受体,从而进一步表明小鼠颈动脉内血小板血栓模型构建成功、依替班肽为对GPⅡb/Ⅲa受体的特异性拮抗。结论1.平行板流动腔实验证明,采用共价连接方法成功构建的携RGD环寡肽序列的血栓靶向超声微泡(MBRGD)具有较强的主动特异性结合及抵抗较高剪切应力冲刷的能力。2.体内血小板荧光实验表明AA作用于颈动脉外膜可使颈动脉内产生血小板血栓,可为实验研究提供一种新的高度模拟体内炎症性血小板血栓的动物模型。3.结合CEU行超声分子成像,MBRGD的血小板血栓靶向成像优于MBCON,,且为特异性靶向,而可有效评价动脉内活化血小板及其血栓形成。