三七皂苷R1对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用及其机制的初步研究

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zoudehenhao
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是引起新生儿急性死亡、慢性神经系统损伤及脑发育滞后的主要原因之一。脑缺氧缺血性损伤最直接和最严重的后果是神经元死亡,保护神经元的正常存活、减少死亡是研究和解决神经系统疾病的最重要策略之一。近年研究发现,雌激素可影响脑缺氧缺血性损伤进程,具神经保护效应,其机制可能与调控相关信号通路抑制神经元凋亡、减轻自自由基损伤、抑制钙内流和减弱兴奋性氨基酸毒性等相关。雌激素发挥神经保护效应主要通过作用于雌激素受体(Estrogen receptor,ER)实现,而三七皂苷R1(Notoginsenoside R1,NGR1)作为天然植物雌激素受体激动剂,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和神经保护作用,在多种脏器功能损伤中发挥保护效应,但NGR1是否对新生大鼠HIE损伤具保护作用未见报道,值得进一步探索。脑缺氧缺血性损伤后,神经元中多条调节细胞存活与死亡的信号通路被激活,其中,PI3K-Akt-m TOR通路主要调节细胞存活、增殖与分化,抑制凋亡,在脑缺氧缺血性损伤中发挥显著的神经保护作用。JNK通路可通过活化下游促凋亡基因c-Jun,引起或促进细胞凋亡。PI3K-Akt和JNK这两条走向截然相反的通路之间的力量对比,可能决定了脑缺氧缺血性损伤后神经元的存活或死亡。Akt被PI3K激活后,一方面可继续激活下游m TOR信号,促进细胞生存与增殖;另一方面通过直接或间接途径,抑制JNK激活,减少神经元凋亡。由此可见,整个通路中PI3K活性的高低,起着非常关键的作用。同时众多学者发现,ER可与PI3K直接作用或通过支架蛋白(如CAV-1)、连接蛋白(如Src、Shc)、生长因子等与PI3K的p85亚基结合形成粘着斑复合物,激活下游Akt家族,引起一系列信号通路级联反应。由此我们推测,NGR1是否可能作用于ER,以PI3K为作用靶点,通过调控PI3K-Akt和JNK通路的活性,保护神经元。综上,本课题以NGR1、ER、PI3K-Akt-m TOR和JNK信号通路为轴心线索,初步探讨NGR1在HIE中的作用及机制。第一部分NGR1对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用目的建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的体内、体外模型,探讨NGR1对大鼠的神经保护作用。方法:1.模型建立:(1)离体培养新生SD大鼠皮层神经元细胞,给予氧糖剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)建立大鼠皮层神经元OGD/R模型;(2)取用新生7天SD乳鼠,建立体内HIE模型。2.分组:对照组(CON或sham组),OGD/R(HIE)模型组,模型+NGR1治疗组,模型+DMSO(二甲亚砜,Dimethyl sulfoxide,为溶剂对照vehicle)组。3.检测指标:(1)体外实验:通过MTT法检测神经元细胞存活率;LDH检测细胞膜完整性来评估皮层神经元OGD/R损伤及NGR1的保护作用。(2)体内实验:通过检测大鼠脑组织含水量、脑梗死面积、光镜观察脑组织病理损伤、激光多普勒血流仪检测脑血流量、神经行为学检测(平衡木实验、转角试验及水迷宫实验)、TUNEL凋亡细胞检测等评估大鼠HIE损伤及NGR1的神经保护作用。结果:1.体外实验发现,相比于OGD/R模型组,NGR1治疗组神经元存活率明显提高,LDH漏出率降低。2.体内实验发现,与HIE模型组相比,NGR1治疗组脑水肿减轻;梗死面积明显缩小;病理损伤减轻;脑血流量增加;建模5周神经行为学测试其肢体运动协调平衡力及学习记忆力显著改善;TUNEL凋亡细胞数目减少等。结论NGR1对皮层神经元OGD/R损伤及新生大鼠HIE损伤均具有显著的保护效应(上述指标统计学分析均P<0.05或P<0.01)。第二部分NGR1对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用机制的初步探讨第一节NGR1的神经保护作用与雌激素受体相关目的探讨NGR1是否通过作用于ER发挥神经保护效应。方法1.分组:对照组(CON或sham组),OGD/R(HIE)组,OGD/R(HIE)+NGR1治疗组,OGD/R(HIE)+NGR1+ICI182780(ER受体阻断剂)组,OGD/R(HIE)+ICI182780组2.检测指标:(1)Western Blot检测OGD/R和HIE损伤后ER表达的时相变化(2)MTT法检测各组神经元细胞存活率、LDH检测细胞膜完整性(3)检测各组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积、光镜观察脑组织病理损伤、激光多普勒血流仪检测脑血流量、神经行为学检测(平衡木实验、转角试验及水迷宫实验)、TUNEL凋亡细胞计数等。结果1.体内、体外实验均发现,OGD/R或HIE损伤后,神经元ER蛋白表达逐渐下降,24h降到最低,该效应可持续到48h,提示ER参与体内外缺氧缺血性脑损伤。2.体内、体外实验中均使用ER阻断剂ICI18780,结果提示:(1)ICI182780可阻断NGR1对皮层神经元OGD/R损伤的保护效应,使神经元存活率下降,LDH漏出率增高。(2)ICI182780可阻断NGR1对新生大鼠HIE模型脑损伤的保护效应,与NGR1治疗组相比,阻断剂组脑水肿加重、梗死面积明显增加、病理损伤加重、脑血流量减少、建模5周神经行为学测试提示脑损伤加重、TUNEL凋亡细胞数目增加等。结论NGR1可能通过ER来发挥对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用,使用ER阻断剂ICI182780,可明显抑制NGR1的神经保护效应(上述指标统计学分析均P<0.05或P<0.01)。第二节NGR1通过ER调控PI3K-Akt-m TOR和JNK信号通路发挥神经保护效应目的探讨NGR1的神经保护作用是否与通过ER调控了PI3K-Aktm TOR和JNK信号通路相关。方法1.分组:(1)NGR1通过ER调控PI3K-Akt-m TOR和JNK信号通路:对照组(CON或sham),OGD/R(HIE)24h组,OGD/R(HIE)24h+NGR1治疗组,OGD/R(HIE)24h+NGR1+ICI182780组(2)NGR1以PI3K为靶点,调控整个下游通路的活性:对照组(CON或sham);OGD/R24h组;OGD/R24h+NGR1组;OGD24h+NGR1+ICI182780+740Y-P(PI3K激动剂)组;OGD24h+NGR1+LY294002(PI3K阻断剂)组2.检测指标:(1)Western Blot检测OGD/R和HIE损伤后PI3K表达的时相变化(2)Western Blot检测OGD/R和HIE损伤后24h各组PI3K-Akt-m TOR和JNK信号通路蛋白表达的变化。(3)MTT法检测各组神经元细胞存活率、LDH检测细胞膜完整性结果1.体内、体外实验均发现,OGD/R或HIE建模后24h,模型组PI3K蛋白表达逐渐下降,24h降到峰值,该效应可持续到48h,提示PI3K信号通路参与体内外缺氧缺血性脑损伤。2.体内、体外实验结果均显示,相比于模型组,NGR1治疗组PI3K表达显著增加,其下游Akt-m TOR-4EBP-1(P70S6K)磷酸化表达明显上升,JNK和c-Jun的磷酸化表达显著下降;而使用ER阻断剂ICI182780后,可基本阻断NGR1的保护效应,表现为与NGR1治疗组相比,阻断剂组PI3K-Akt-m TOR-4EBP-1(P70S6K)通路受到抑制,而JNK和c-Jun通路明显激活。3.为进一步推测并确定NGR1作用的靶点,我们又使用PI3K阻断剂LY294002和激动剂740Y-P进行实验。结果发现,LY294002可使NGR1治疗组细胞存活率下降,LDH漏出率上升,Akt表达下降,JNK表达上升;而PI3K激动剂740Y-P则可使ICI182780对NGR1的阻断效应反转,细胞存活率上升,LDH漏出率下降,Akt表达上升,JNK表达抑制。结论:1.NGR1可能通过ER,调控PI3K-Akt-m TOR信号通路及JNK信号通路发挥神经保护效应(上述指标统计学分析均P<0.05或P<0.01)。2.PI3K可能是NGR1通过ER作用的靶点。
其他文献
近年来土地利用变化引起的生态环境效应备受关注,本文以“中国蜜桔之乡”南丰县为研究区,选取南丰县东南部太和镇丹阳村的小流域作为采样区。基于2003和2016年两期高清遥感影像并结合地统计学方法,分析了太和镇近14年来土地利用时空变化特征;在采样区选择水田、桔园、稻田桔园(由水稻田转化的桔园)、人工杉树林、湿地松林、灌木林、毛竹林、脐橙园作为样地,研究8种土地利用方式下土壤侵蚀与土壤肥力变化特征,探讨
19世纪到达澳门的西洋画家曾经对澳门的风景、建筑和人物作了大量水彩写生.其中钱纳利的画以纯粹的英国水彩技法,描绘流动的空气与瞬间的阳光.这一时期西洋水彩画技术直接输
目的:本研究旨在通过回顾性分析胸部放射治疗期间同步或序贯口服酪氨酸激酶抑制剂的晚期非小细胞肺癌患者中,放疗相关放射性肺炎的发生率以及影像学表现严重程度的差异,研究
长大下坡路段往往是交通事故多发路段,文章基于实测数据,分析长大下坡路段道路线型设计的交通安全影响因素,总结出下坡路段道路加速度模型,根据加速度变化量与交通安全之间的
遗传多样性和物种多样性是生物多样性中最基本、最重要的两个层次。尽管有关植物种群遗传多样性和群落物种多样性的研究已经开展了大量的工作,但这些研究大多数是分别进行的,
以一款图形电镀后出现孔口发白的不良PCB为例,对其产生异常的原因进行试验查找及分析,并针对此类不良提出了具体的改善措施,为同行业在进行图形电镀制作时提供一定的参考依据
牛真胃炎为养牛常见多发的消化系统疾病,此病诱因较复杂,与饲料因素、养殖管理不规范、继发其他疾病等有着很大的关系。调查的易感病例中,以老龄畜、体质孱弱的成年牛等易感
<正>5月份,伴随着国际油价逐步回升,全球原油贸易日趋活跃,带动国际原油运输市场快速回升。其中,VLCC海湾/日本航线运价指数一度冲至WS78点,之后租家有意延缓出货节奏,到5月2
目的比较静脉和口服补铁对血液透析患者铁缺乏和贫血的治疗效果.方法选择41例维持性血液透析患者,平均透析时间10.3&#177;8.8个月,每周透析2~3次.试验前检查每位患者的血红蛋
建立超高效液相色谱–串联质谱法测定贝类中脂溶性贝类毒素。样品组织经100%甲醇提取过滤后直接进样用于测定游离态的原多甲藻酸毒素(AZA1,AZA2和AZA3)、大田软海绵酸(OA)、