【摘 要】
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作为必需的矿物元素,锌广泛参与鱼体内的各种代谢过程,而锌的代谢紊乱会对鱼类造成不利的影响。鱼体内锌稳态平衡是由一些关键蛋白共同调控的,其中包括锌转运蛋白（Zn Ts和ZIPs家族）、金属硫蛋白（MTs）和金属反应转录因子1（MTF-1）。本研究以淡水经济养殖鱼类黄颡鱼为研究对象,对黄颡鱼锌稳态关键基因和启动子进行了克隆和功能解析,并在饲料中添加无机锌（七水硫酸锌）和纳米锌（纳米氧化锌）,深入探究锌
【基金项目】
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国家自然科学基金（资助号:32030111,31872585）； 国家重点研发计划重点专项（资助号:2018YFD0900400,2018YFD0900600）；
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作为必需的矿物元素,锌广泛参与鱼体内的各种代谢过程,而锌的代谢紊乱会对鱼类造成不利的影响。鱼体内锌稳态平衡是由一些关键蛋白共同调控的,其中包括锌转运蛋白（Zn Ts和ZIPs家族）、金属硫蛋白（MTs）和金属反应转录因子1（MTF-1）。本研究以淡水经济养殖鱼类黄颡鱼为研究对象,对黄颡鱼锌稳态关键基因和启动子进行了克隆和功能解析,并在饲料中添加无机锌（七水硫酸锌）和纳米锌（纳米氧化锌）,深入探究锌代谢紊乱对黄颡鱼脂类代谢及沉积的影响及其分子机制。主要结果如下:1、黄颡鱼锌稳态关键基因克隆及功能解析为了初步探究黄颡鱼锌稳态基因的调控机制,利用RACE技术,克隆得到了黄颡鱼6个锌稳态关键基因（znt1、znt5、znt7、zip4、zip5和mtf-1）全长c DNA,分别为2816 bp、2792 bp、2017 bp、3664 bp、2921 bp和4904 bp,并分析了其结构域和同源性,构建了进化树。组织表达谱分析表明这些基因广泛存在于8个检测组织（肠道、肝脏、脑、心脏、鳃、肌肉、脾和肠系膜脂肪）中,但在不同的组织中的表达水平不同。此外,这些基因对不同水体锌浓度的响应表现出时间和浓度依赖性。本研究为探索锌稳态平衡的生理功能奠定了良好的基础,为探究鱼类锌稳态调控机制提供了新的研究思路。2、黄颡鱼锌稳态关键基因MTF-1和MT启动子克隆及功能解析为了进一步探究黄颡鱼锌稳态的调控机制,克隆得到了黄颡鱼mtf-1和mt基因启动子,其序列长度分别为1845 bp和802 bp。锌孵育提高了mt和mtf-1启动子活性;锌通过mtf-1启动子上的热休克反应元件（HSE）位点调节mtf-1的转录活性;锌通过mt启动子上的金属反应元件(MRE位点调节mt的转录活性;通过EMSA实验进一步确定了mtf-1和mt启动子上的功能结合位点。此外,锌处理诱导了黄颡鱼肝细胞中mt的基因表达以及MTF-1的基因、核蛋白和总蛋白表达水平。本研究揭示了锌处理下MT和MTF-1的转录调控方式,为进一步探究鱼类锌稳态调控机制提供了新的研究思路。3、饲料无机锌的添加对黄颡鱼肠道锌代谢及脂代谢的影响为了探究饲料中无机锌的添加对黄颡鱼肠道锌代谢以及脂代谢的影响,将8.83mg Zn/kg（锌缺乏组）、19.20 mg Zn/kg（适量锌组）和146.65 mg Zn/kg（锌过量组）三种饲料分别饲喂幼黄颡鱼8周。研究发现,饲料中锌的添加增加了黄颡鱼前肠和中肠锌的积累,但降低了黄颡鱼前肠和中肠的TG含量。锌积累的增加是由于参与锌吸收和转运有关酶活性和基因表达的变化。黄颡鱼前肠和中肠中TG含量的降低主要是由于锌添加促进了脂类分解和抑制了脂类合成。此外,研究发现黄颡鱼在前肠和中肠中锌和脂代谢相关酶活和基因的表达存在相似的调控机制。本研究为鱼类矿物元素锌的精准营养调控提供了参考。4、线粒体ROS介导纳米氧化锌诱导黄颡鱼肝脏脂类代谢的作用机制为了探究纳米氧化锌调控鱼类脂类代谢的潜在分子机制,将对照组（0）、低ZnO NP组（10 mg/kg ZnO NP）、高ZnO NP组（100 mg/kg ZnO NP）和高ZnO NP+TPEN组（100 mg/kg ZnO NP+10 mg TPEN）四种ZnO NP不同含量的饲料分别饲喂黄颡鱼10周。研究发现饲料中纳米氧化锌的添加扰乱了黄颡鱼肝脏锌代谢和脂代谢,显著增加了肝脏锌和脂类积累,并诱导了氧化应激以及激活了线粒体自噬。饲料中TPEN添加可减轻高纳米氧化锌组诱导的锌和脂类积累、氧化应激以及线粒体自噬。利用黄颡鱼原代肝细胞,我们发现TPEN减弱了纳米氧化锌诱导的锌和脂类沉积。进一步的研究发现,线粒体ROS的抑制减弱了纳米氧化锌激活的线粒体自噬和纳米氧化锌诱导的肝细胞脂类沉积。同时发现,ZnO NP可以通过MTF-1通路直接调控cpt1a1b的表达,进而抑制了基因的转录,从而导致脂类的沉积。本研究为矿物元素调控脂类代谢的直接关系提供了新的证据。
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