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鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）又称小鹅瘟病毒，可引起4~20日龄雏鹅的急性或亚急性及败血性传染病，具有高度传染性及高死亡率，以肠道出现栓塞为主要病变特征。该病于1956年由我国学者方定一首先发现并命名，后在世界各国相继出现。鹅细小病毒属于细小病毒科、细小病毒属、单股线性DNA病毒。通过电镜观察，病毒粒子呈球形，直径20nm左右。该病毒有三种结构蛋白，其中VP3蛋白为主要的衣壳蛋白，并含有GPV主要的抗原决定簇。研究鹅细小病毒的流行情况并建立快速有效的检测方法，是控制该病的有效措施。本研究成功地制备了抗鹅细小病毒的单克隆抗体，并建立了针对鹅细小病毒的胶体金检测方法，为防治该病提供了技术支持。本研究内容分为以下两个部分： 1．抗GPV单克隆抗体的制备 本研究利用GPV病毒液接种11日龄健康鹅胚并收取24~96h死亡胚的尿囊液，通过超速离心法对尿囊液进行浓缩，并将浓缩的尿囊液利用蔗糖密度梯度离心法进行纯化，得到纯化的GPV病毒液。利用纯化的GPV病毒液作为免疫原免疫6~8周龄的BALB/c小鼠，经过细胞融合和ELISA方法对阳性克隆进行筛选，最终得到3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为A2D2、B5D2和C3B2，并对B5D2和C3B2进行相关特性鉴定。经单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定，B5D2和C3B2抗体亚类均为IgG1型。经ELISA效价测定，两株单抗的细胞上清效价均为1：100，诱导产生腹水的效价分别为1：128000和1：64000。间接ELISA结果表明，两株单抗只与GPV反应，与AIV、DHV、NDV等病毒无交叉反应性。IFA结果表明，两株单抗均可与纯化的GPV病毒液以及鹅细小病毒发生特异性反应。抗GPV单克隆抗体的成功研制，为GPV的免疫学诊断及致病机理的研究奠定基础。 2．鹅细小病毒胶体金检测试纸条的研制及应用 本研究首先利用实验室保存的GPV VP3 重组蛋白与弗氏佐剂混和后免疫健康家兔，经过4次免疫，两个月后采血并制备血清，通过ELISA方法检测血清抗体效价，正辛酸硫酸铵法对血清进行纯化,得到纯化GPV，再次利用ILISA方法检测其效价，结果表明抗体效价可达1：1000。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，并确定胶体金与待标记单克隆抗体结合的最佳浓度为 9μg。以胶体金标记的抗GPV单克隆抗体B5D2作为金标抗体，以鼠抗VP3蛋白多克隆抗体为包被抗体，建立了胶体金免疫层析试纸条检测鹅细小病毒的方法。将GPV病毒液进行梯度稀释后分别通过琼扩试验、PCR试验及胶体金检测试纸条检测，试验结果表明，胶体金试纸条可检出的最高病毒稀释倍数为10-4，其敏感性虽然比PCR稍低，但比琼脂扩散试验高出100倍。分别用胶体金试纸条检测实验室保存的鹅细小病毒、番鸭细小病毒、H9 禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、坦布苏病毒、禽腺病毒、呼肠孤病毒及水禽副黏病毒，结果显示其特异性良好，无交叉反应的现象。将试纸条分别储存于4℃及室温下，每月重新进行敏感性及特异性试验，结果显示试纸条性能在半年内未出现明显降低。对实验室保存的92份疑似感GPV的临床样品分别利用胶体金试纸条，琼扩试验及PCR进行检测，检测结果表明，胶体金试纸条方法和PCR方法检测38份组织匀浆上清液样品的的检出率分别为84.2%、97.3%，检测54份尿囊液样品的检出率分别为88.8%、92.6%，两者符合率分别为76.4%及96%，总体符合率为91.9%。本研究建立的鹅细小病毒胶体金免疫层析检测方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，为鹅细小病毒的快速诊断提供了新的方法。