肺炎衣原体是一类严格的活细胞内寄生的、具有独特生活周期的微生物。其复制和生物合成是在被感染的宿主细胞内形成的包涵体中进行的,因此包涵体是衣原体赖以生存和繁殖的微环境,为了建立和维持衣原体在感染细胞包涵体内的生长,就必须通过包涵体膜与宿主细胞进行物质和信号的交换。自从1995年Rochey等用实验首次证实衣原体通过自身表达的蛋白而主动修饰包涵体膜以来,陆续有新的包涵体膜蛋白被鉴定出来,并对部分包涵体膜蛋白的生物学作用进行了研究,初步显示包涵体膜蛋白参与与宿主间的相互作用及其致病性。由于包涵体膜蛋白在研究衣原体中发育以及致病过程中的重要地位,寻找并探究包涵体膜蛋白的生物学作用成为研究的热点之一。根据已经鉴定的膜蛋白的疏水性特征,计算机辅助程序预测出90个肺炎衣原体(CPn)基因编码的蛋白为候选包涵体膜蛋白,但目前通过直接抗体标记检测证实的包涵体膜蛋白为数不多。已有的发现提示并非所有计算机预测的包涵体膜蛋白均位于包涵体膜上。因此使用试验方法发现和确认假定的包涵体膜蛋白并进一步探讨其特性对深入了解衣原体的生物学作用、致病性以及预防具有重要意义。CPn0308是预测的包涵体膜蛋白,是否定位于包涵体膜上尚有待于进一步确认。为此本研究在检索CPn基因库信息的基础上,分析CPn0308及其相关基因的特性;克隆CPn0308及其相关基因并表达其GST融合蛋白;制备多克隆和单克隆抗体,对内源性蛋白的表达进行定位;在定位的基础上对其特性进一步研究,以期为更全面了解衣原体包涵体膜蛋白的生物学作用提供信息。第一部分CPn0308及其相关基因的克隆与表达目的:分析和克隆CPn0308和与其相关的其他衣原体基因(包括CT249、MoPn052和GPIC0474)的基础上,进一步表达相关的蛋白,为后续制备抗体、鉴定包涵体膜蛋白奠定基础。方法:①依据文献提供的信息,检索CPn0308信息,根据检索提示,进行相关分析。②选择肺炎衣原体CPn0308基因的开放读码框架区的基因和相关基因CT249、MoPn0520、GPIC0474以及所用的克隆和表达载体pGEX-6P2设计引物;采用PCR方法获取目的基因。③采用常规的酚-氯仿法提纯扩增的目的基因,进行限制性内切酶酶切处理。④用T4连接酶连接纯化后的消化产物与预处理的pGEX-6P2载体,然后转化感受态细胞XL1-blue,接种在含有100μg/ml AMP的选择性培养基LB平板上,37℃过夜培养。⑤采用针对pGEX-6P2载体的PCR初步筛选选择性培养基上生长的克隆;对PCR扩增阳性的克隆提取质粒,进一步采用交叉-PCR进行鉴定;交叉PCR扩增阳性的质粒进行测序并进行序列分析。⑥用IPTG诱导序列正确的克隆表达GST重组蛋白,用Glutathione Sepharose TM 4B纯化重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果:①CPn0308基因长度为366bps,编码121个氨基酸残基,分子量为12.971kDa。CT249、GPIC0474和MoPn0520在基因结构与CPn0308具有相似性。一个基因独自为一个基因群,两侧均为已知的基因glgP和dnaA,编码的氨基酸残基数相似。②获得了载体重组质粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX-6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2 /GPIC0474。经过用针对pGEX-6P2载体的引物初步筛选后进一步提取重组质粒,经过pGEX-6P2的引物和特异性引物进行交叉PCR扩增,获得的扩增产物与预期结果一致。直接以重组质粒pGEX-6P2/CPn0308、pGEX- 6P2/CT249、pGEX-6P2/MoPn0520和pGEX-6P2/GPIC0474为模板进行测序,得到克隆片段的DNA序列,与基因库中的序列比对的一致性均为100%,进一步分析发现均含有两个跨膜区域。③选取阳性克隆诱导表达重组蛋白,经过纯化后进行SDS-PAGE电泳,显示条带与预期结果一致。结论:①CPn0308及其相关的CT249、MoPn0520以及GPIC 0474基因结构相似。②成功地将CPn0308以及CT249、MoPn0520和GPIC0474克隆到pGEX-6P2载体中,并表达出GST-CPn0308等四个GST融合蛋白。第二部分CPn0308、CT249、MoPn0520和GPIC0474抗体制备及应用目的:本研究在第一部分克隆、表达蛋白基础上进一步制备CPn0308及其相关蛋白的多克隆抗体以及CPn0308的单克隆抗体;采用抗体标记检测法对四种内源性蛋白进行初步定位分析,以期为深入探究这些假定蛋白的生物学作用奠定基础。方法:①用Glutathione Sepharose TM 4B纯化融合蛋白GST-CPn 0308、GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474作为免疫原,常规方法免疫Balb/C小鼠,分离血清获得多克隆抗体。对GST-CPn0308蛋白,常规方法制备单克隆抗体。②采用IFA进行筛选阳性克隆和效价滴定。③用IFA方法对所获取的单克隆抗体进行类别的鉴定;应用Western Blotting技术进行检测抗体所识别的CPn0308的部位特异性和识别部位的鉴定。④用所制备的抗体进行不同组合的IFA对四种抗体所对应的内源性蛋白进行初步定位。进一步用吸附试验和抗GST-CPn0308的多克隆抗体直接对四个不同种属的衣原体(AR39、L2、MoPn和GPIC)感染后的HeLa细胞进行IFA分析CPn0308与其他三个蛋白的同源性。结果:①IFA测试血清的效价如下:CPn0308、MoPn0520、CT249和GPIC0474分别为1:2000、1:200、1:2000和1:200。②制备CPn0308的单克隆抗体获得四株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为2D7、3A6、3H5、5E10;单克隆抗体均为IgG类抗体,其中2D7为IgG3亚类、3A6为IgG1亚类、3H5和5E10均为IgG2b亚类;四株单克隆抗体识别CPn0308的部位均为CPn0308N,即靠近氨基端一侧。③IFA结果显示假定衣原体蛋白CPn0308、CT249和MoPn0520位于包涵体膜上,即包涵体膜蛋白,而GPIC0474则不位于包涵体膜上。④与对照比较,用GST-CPn0308蛋白吸附GST-CPn0308的抗体未见包涵体膜蛋白的染色,而用GST-CT249、GST-MoPn0520和GST-GPIC0474吸附后仍然可见GST-CPn0308的抗体的特异性包涵体膜蛋白的染色。用GST-CPn0308的多克隆抗体直接对不同种属的衣原体感染的HeLa进行抗体染色,GST-CPn0308的多克隆抗体只识别AR39感染所形成的包涵体膜蛋白,而不识别其他三种衣原体感染所形成的包涵体膜及其包涵体内的衣原体。结论:①成功制备出四株CPn0308的单克隆抗体(2D7、3A6、3H5和5E10),均为IgG类,识别CPn0308的氨基端。②用多克隆抗体对相应的蛋白进行定位,假定蛋白CPn0308、CT249、MoPn0520位于各自衣原体感染HeLa细胞形成的包涵体膜上,而假定蛋白GPIC0474则不在包涵体膜上。③试验证实CPn0308与CT249、MoPn0520以及GPIC0474没有同源性。第三部分假定蛋白CPn0308特性的初步研究目的:使用抗体标记技术对假定蛋白CPn0308进行鉴定,并对其特性进行初步研究。方法:①用含有R12AR39和CPn0308的多克隆抗体或单克隆抗体作一抗进行IFA,在荧光显微镜下观察假定蛋白CPn0308在感染细胞内的初步定位。②选用已经鉴定的CPn蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60分别与CPn0308进行共染色。在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白CPn0308与其他参照蛋白的定位情况。③使用脂质体2000转染试剂分别转染重组体pDsRed-C1/CPn0308和pDsRed-C1/CPn0186到HeLa细胞,在荧光显微镜下观察CPn0308抗体的染色特性;通过吸附试验观察CPn0308抗体和IncA抗体对包涵体膜蛋白染色的特异性;采用Western Blotting技术检测CPn0308抗体结合内源性以及外源性蛋白的特异性。④分别在AR39感染HeLa细胞后的不同时间点进行IFA实验,观察内源性CPn0308蛋白的表达时相。结果:①使用融合蛋白GST-CPn0308的多克隆抗体和单克隆抗体检测目的蛋白显示初步定位于包涵体膜上。②选择CPn0308的单克隆抗体与参照蛋白CPAFcp、IncA、MOMP和HSP60进行共染色,所检测到信号表明CPn0308与CPAFcp、MOMP和HSP60没有交叉现象,与IncA有重叠现象,均位于细胞膜上,重叠部分的颜色为黄色。进一步使用激光共聚焦显微镜对CPn0308在包涵体膜上的定位,发现CPn0308的存在模式明显不同于CPAFcp、MOMP和HSP60的模式,染色结果显示绿、红、蓝三种颜色。但与IncA有重叠现象,颜色显示为蓝、黄两种颜色。即使从Z轴不同的聚焦点观察,均有与IncA重叠现象。③当用针对CPn0308的多克隆抗体和单克隆抗体对转染的细胞进行染色时显示,pDsRed-C1- CPn0308转染HeLa细胞内表达的蛋白染色为黄色,而pDsRed-C1-CPn 0186转染HeLa细胞内表达的蛋白染色为红色;当用针对CPn0186的单克隆抗体进行染色时,正好相反。与对照相比较,当CPn0308的抗体用GST-CPn0308预吸附后染色可见抗体检测信号消失,而用GST-CPn0186预吸附后染色仍然可见;当CPn0186的抗体用GST-CPn0308预吸附后染色可见检测信号,用GST-CPn0186预吸附后信号消失。与参照抗体检测信号相比,Western Blotting显示用CPn0308的抗体只检测到AR39感染后的HeLa细胞的裂解液和GST-CPn0308有相应的蛋白条带,而其他泳道没有可检测到的蛋白条带。以上从三个不同的方面证实抗体结合包涵体膜的特异性。④在AR39感染后的不同时间点,进行IFA观察显示在感染后24h可明显观察到内源性的CPn0308蛋白表达在包涵体的膜上,并且在整个感染期间一直存在包涵体膜上。结论:①用CPn0308的多克隆抗体和单克隆抗体首次试验证实假定蛋白CPn0308位于CPn感染HeLa细胞形成的包涵体膜上。②共定位发现CPn 0308在包涵体上分布模式类似于IncA,而不同于参照蛋白CPAFcp、MOMP和HSP60。③CPn0308的表达时相为在感染后24h表达于包涵体膜上,并在后续的感染期间一直存在包涵体膜上。第四部分感染肺炎衣原体人群中CPn0308免疫原性的检测分析目的:在分析缺血性脑血管疾病(ICVD)患者肺炎衣原体感染的基础上进一步分析CPn0308的免疫原性。方法:①收集相关的临床标本,分离血浆和提取外周血中单个核细胞(PBMC)中的DNA。②用肺炎衣原体的IgG和IgM诊断试剂盒检测血浆中肺炎衣原体的感染情况。③用PCR法检测分析外周血单个核细胞中肺炎衣原体DNA的存在情况。④用Western Blotting法分析内源性蛋白CPn0308的免疫原性。结果:①在所检测的70例ICVD标本中,IgG的阳性率为51.43%,与对照比较有统计学意义;IgM的阳性率2.86%;与对照比较,无统计学意义。②ICVD患者CPn DNA的阳性率为81.08%,显著高于对照组。③当血浆标本按1:500稀释后,仍可检测到CPn0308的抗体。当用结合GST-CPn 0308的凝胶微粒(Beads)预吸附可中断反应,而用GST-CPn0186 Beads预吸附则不能中断反应,说明反应的特异性。结论:①ICVD患者CPn IgG的阳性率明显升高。②ICVD患者PBMC中CPnDNA阳性率显著升高;检出率高于EIA法,是一种敏感的检测CPn感染的检测方法。③初步分析显示CPn0308在感染人群中具有一定的免疫原性。