TOR(target of rapamycin)是最先在酵母细胞中发现的大型蛋白，它存在于大多数真核生物中。TOR在各种真核生物中都非常保守，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。研究发现，Rapamycin可以与 FKBP12结合形成RAPA-FKBP12复合体，该复合体可以与 TOR结合，封阻 TOR，使其处于非活性状态，抑制 TOR通路的活性。TOR作为一种重要的调节基因通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能，在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用。在酵母及哺乳动物细胞中，TOR的调节作用主要通过两组TOR复合物完成，分别是:TORC1和TORC2.其中，TORC1对雷帕霉素敏感，主要调控由生长因子、能量、营养、逆境等引起的细胞生长方面的变化，如RNA翻译、蛋白质合成等；TORC2则对雷帕霉素不敏感，主要对形成细胞骨架的肌动蛋白起调控作用。　　植物的生长和发育具有很强的可塑性，其形态及器官会因环境的变化发生很大的变化。因此，TOR在植物生长发育中所起的作用也越来越受到关注。在植物中研究发现，拟南芥 TOR(AtTOR)的基因组序列长度为17555bp，cDNA序列长度为8007bp，蛋白序列含2481个氨基酸，分子量为279kDa。拟南芥 TOR突变体纯合子无法完成生活史，由此可见，植物中的TOR对植物的生长发育同样起着举足轻重的作用，有可能是通过调控蛋白质的合成而间接地调控了生长发育。　　与酵母及哺乳动物不同的是，AtTOR对雷帕霉素不敏感，主要是因为AtFKBP12无法与雷帕霉素形成二聚体，也就无法与 AtTOR的FRB域相互作用。但是玉米的TOR蛋白(ZmTOR)对雷帕霉素是敏感的，这可能与各个物种间 FKBP12蛋白的氨基酸组成有关。　　在拟南芥中只有一组AtTOR蛋白复合体，参与了植物生长的调控。AtRaptor作为哺乳动物Raptor的同源基因，能与 AtTOR结合组成AtTORC，调控下游作用因子。拟南芥中没有与 Rictor(TORC2蛋白之一)同源的基因。　　作为近几年新兴的一种耐盐模式植物，盐芥在植物耐逆性，尤其是耐盐性的研究中已经广泛应用。盐芥的耐逆性远强于拟南芥，但其生长周期也比拟南芥要长很多。本实验对AtTOR利用多个分子生物学手段进行了研究，同时克隆了ThTOR基因，对ThTOR也进行了一些初步研究。　　主要结果如下:　　1)分析 AtTOR的cDNA序列，从中选择出特异性较强的两段序列，分别位于AtTOR的5’端 HEAT domain区和3’端激酶区，分别构建 AtTOR-RNAi植物表达载体，并转化拟南芥，获得拟南芥的AtTOR基因沉默株系。对获得的转基因株系进行分子鉴定后，选择 AtTOR表达量下调的株系用作表型分析。结果发现，沉默株系的生长比野生型要缓慢，而且用5’端片段进行基因沉默的植株，还有败育，及苔丛生等特点。转基因株系的愈伤组织的生长情况也不如野生型。　　2)分析 AtTOR的启动子序列，PCR获得全长序列。用PlantCARE数据库进行预测，获得的启动子中除了启动子必须的TATA-box和GAAT-box，还含有7个 ABA反应元件ABRE、1个干旱响应元件 DRE、热响应元件 HSE一个、以及许多与植物发育相关的元件。构建不同长度的启动子-GUS融合表达载体，获得转基因植株后，进行GUS染色，发现AtTOR特异地在胚轴、下胚轴与根部结合处以及叶原基处表达。但是不用长度的启动子定位和染色强弱有所不同。全长启动子-GUS没有表达，而最短的644 bp启动子 GUS表达量相对较高，但是定位特异性降低。由此分析，在整个启动子序列中，可能还存在未知的抑制因子或定位作用因子。　　3)用软件 TargetP1.1预测 AtTOR蛋白的亚细胞定位，预测结果是叶绿体。用DNAMAN软件预测 AtTOR蛋白的跨膜区，预测 AtTOR有两段跨膜区。选取可能存在信号肽的AtTOR蛋白的5’端和3’端序列，以及两段跨膜区，构建 AtTOR-GFP融合蛋白植物表达载体。用激光共聚焦显微镜观察转基因株系的根及叶的下表皮，根内的GFP表达均匀，无特异的定位信号；而地上部分的定位结果则显示是叶绿体，与预测一致。但由于只是用了总蛋白其中的片段进行定位，因此定位信号并不是准确无误的。必须通过进一步的原位杂交和免疫组化实验，用抗体的特异结合，来确定 AtTOR真正的亚细胞定位。　　4)不同的胁迫处理会使 AtTOR表达量发生变化，将处于营养生长旺盛期的拟南芥分别用150 mM NaCl、29.1 mM PEG6000、300 mM甘露醇、75μM ABA、37℃、4℃分别处理0h、3h、6h、12h、24h、48h；用20μM醋酸铅和20μM CuCl2分别处理12h、24h、48h；分别用0 mM、50 mM、100 mM、150 mM和200 mM的NaCl处理24h。由于AtTOR在拟南芥中本底水平表达量很低，用Northern杂交的方法无法检测到 AtTOR的信号，因此，本实验以未处理的野生型拟南芥做对照，用Realtime-PCR的方法对AtTOR表达水平进行分析。渗透、冷、热、ABA均能大幅度上调 AtTOR的表达量。NaCl和重金属则降低了AtTOR的表达量。　　AtTOR在拟南芥各器官中的表达也有较大差异，以莲座叶为对照，茎中最低，低于莲座叶；在茎生叶中最高，其次是花和果荚，根和萌发10天的幼苗中的表达量也高于莲座叶。　　5)采用RT-PCR、3’-RACE和5’-RACE的方法从盐芥中克隆获得了ThTOR的cDNA。所获得的ThTOR基因的cDNA全长7836 bp，开放读码框为7437 bp，5’非编码区为196 bp，3’非编码区为203 bp，ThTOR编码2479个氨基酸，分子量为279 kDa。分析发现，ThTOR的cDNA序列与 AtTOR的cDNA序列同源性约为95％，二者的蛋白序列同源性高达97。5％。ThTOR也具有TOR基本的结构域:FAT域，1309-1887 Aa；FRB域，1920-2023 Aa；激酶域，2090-2340 Aa；FATC域，2447-2479 Aa。　　根据获得的ThTOR基因 cDNA序列设计引物，扩增 ThTOR的基因组序列。获得的整个 ThTOR基因组序列长度为19162 bp，其中含有55段内含子和56段外显子。　　为了更好的研究ThTOR及AtTOR基因功能的差异，分析 ThTOR的基因组序列中的酶切位点，将 ThTOR的基因组分成7段分别克隆，测序检测正确后，将7段序列连接成完整的ThTOR基因组，构建 ThTOR基因组植物过量表达载体，拟转化野生型拟南芥和AtTOR的沉默株系。　　6)分析 ThTOR的cDNA序列，选择 FAT域的一段特异区用来构建 ThTOR基因沉默植物表达载体。转化盐芥，获得盐芥的ThTOR基因沉默株系。对获得的转基因株系进行分子鉴定后，选择 ThTOR表达量下调的株系 ThI5和ThI6用作表型分析。盐芥沉默株系的表型与拟南芥接近，生长比野生型要缓慢，种子也有败育现象。　　7)与拟南芥相同，用不同的胁迫条件处理盐芥，ThTOR的表达量也会有变化。将处于营养生长旺盛期的盐芥分别用250 mM NaCl、34.9 mM PEG6000、500 mM甘露醇、75μM ABA、37℃、4℃分别处理0h、3h、6h、12h、24h、48h；用20μM醋酸铅和20μM CuCl2分别处理12h、24h、48h；分别用0 mM、100 mM、200 mM、300 mM和400 mM的NaCl处理24h。用Realtime-PCR的方法鉴定 ThTOR基因表达情况。盐、渗透、冷、热、ABA、重金属处理，均能引起 ThTOR表达量的上调。　　对盐芥各器官中ThTOR的表达水平研究发现，以未春化的莲座叶做对照，ThTOR基因的表达量在茎中最低，其次是根和萌发10天的幼苗，略低于对照；在茎生叶中最高，其次是花和果荚，春化后根和莲座叶中的表达量也高于对照。　　8)研究已经发现，拟南芥的生长对雷帕霉素不敏感，而玉米则对雷帕霉素敏感。用雷帕霉素处理盐芥和拟南芥，与拟南芥对照观察盐芥在含雷帕霉素的MS0培养基上的萌发情况及生长情况。结果发现，在普通 MS0培养基上萌发4天后又移到含雷帕霉素的MS0培养基上继续生长6天后，盐芥和拟南芥的生长均未受到影响。用Realtime-PCR检测其中TOR基因的表达量，发现雷帕霉素几乎没有引起 AtTOR和ThTOR表达量的变化。　　而直接播种在含雷帕霉素的MS0培养基上的盐芥种子，几乎不能萌发，萌发7天后，萌发率不到10％，继续生长也不能够萌发。拟南芥的萌发在最初的几天也受到了抑制，但是仅仅是萌发速度有所减缓，萌发7天后，种于含雷帕霉素的MS0培养基上的种子萌发率即达到跟对照一样的水平。　　本研究的主要创新点及意义:　　1、首次对AtTOR的启动子序列进行了分析、克隆及表达分析，结合 AtTOR的表达模式，证实了启动子中的顺式调控因子的作用；确定了AtTOR在拟南芥体内的主要表达区域，对AtTOR基因沉默株系的表型也有了相应解释。　　2、首次对AtTOR的亚细胞定位进行了研究，为深入研究AtTOR基因的功能打下基础。　　3、首次克隆了盐芥 ThTOR基因的cDNA全长和基因组全长。对ThTOR蛋白的结构进行了较为详细的分析，并且对ThTOR基因组序列也进行了详细分析。构建了沉默表达载体和基因组过量表达载体，成功将沉默表达载体转入盐芥，并观察了转基因盐芥的表型。　　4、首次发现雷帕霉素对盐芥的生长没有影响，但是却对盐芥和拟南芥的萌发有影响，这为以后对植物TOR的研究有找到了新的突破点。