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水酶法由于在环保以及脂质和蛋白质综合利用方面的优势,越来越受到关注。但是水酶法需要外加商业蛋白酶,增加了加工成本。本实验室的前期研究发现,芝麻浆离心所得到的上浮乳状液(油体富集物)中含有活性较强的内源性蛋白酶,具有代替商业蛋白酶制剂来酶解芝麻油体富集物制油的潜力。但是,目前对于这些内源性蛋白酶的水解条件还没有系统研究。基于此,本研究的思路如下:首先考察离心分离前的预处理对于脂质和蛋白质分离效果的影响,再系统考察了油体富集物中内源性蛋白酶的种类及其水解条件,最后考察内源性蛋白酶对于油体富集物破乳制油的作用效果。首先,探究了芝麻浆液的制备及其离心分离的工艺条件。结果表明,三次打浆可以使得芝麻中90%以上的脂质、87%的蛋白质和89%的固形物进入浆液。当浆液调节pH至8.0,离心可使浆液中80%的脂质和7%的蛋白质分布于油体富集物中。其次,对油体富集物中的内源性蛋白酶系进行了鉴定,并考察了水解pH范围和温度范围。LC-MS/MS以及二维电泳和MALDI-TOF/TOF-MS联用的检测结果表明,油体富集物中含有多种内源性蛋白酶,包括内肽酶和外肽酶:内肽酶包括7种天冬氨酸蛋白酶,2种丝氨酸蛋白酶,3种金属蛋白酶;外肽酶包括1种三肽基肽酶II和2种丝氨酸羧肽酶。相对丰度:天冬氨酸蛋白酶>丝氨酸蛋白酶>金属蛋白酶。油质蛋白在pH3.0~9.0范围内被水解,在pH 4.0时水解速度最快;而非油体蛋白在pH 3.0~4.0被水解,在pH 3.0时水解速度最快。在30~60℃范围内,内源性蛋白酶可以水解油质蛋白,最适温度为50℃。上述较宽的水解pH范围与多种内源性蛋白酶的存在相符。接着,通过酶抑制剂实验、LC-MS/MS和游离氨基酸分析确定了发挥水解作用的内源性蛋白酶种类,并考察了各种内源性蛋白酶的水解pH范围。结果显示,发挥水解作用的内源性蛋白酶为天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(包括内肽酶和外肽酶)和金属蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶的水解pH为3.0~6.0,最适pH为4.0;丝氨酸蛋白酶(内肽酶:类枯草杆菌蛋白酶和丝氨酸蛋白酶SPPA)的水解pH为4.0~9.0,在pH 5.0时活性最强,其中,酸性pH区域的水解活性由类枯草杆菌蛋白酶提供。丝氨酸羧肽酶可以在pH3.0~9.0发挥水解作用,pH 4.0时活性最强。金属蛋白酶可在碱性pH区域发挥水解作用。与上述鉴定结果相符。随后,基于油体富集物中内源性蛋白酶系的水解条件,系统考察了水解时间、固形物含量、油体粒径和蛋白质含量对于油体富集物破乳的影响。结果表明,水解时间越长越容易破乳,粒径越大越容易破乳,蛋白质含量越低越容易破乳。当固形物含量为50%,在pH 4.0、50℃水浴2 h,破乳率可达86%。最后,为了进一步提高破乳率,考察了冷冻-解冻辅助对于破乳率的影响,并对油的品质进行了评价。结果表明,仅冷冻-解冻处理的破乳率(破乳率约71%)远低于内源性蛋白酶系水解后再冷冻-解冻的破乳率。水解2 h后再进行冷冻-解冻处理,破乳率可达94.22%。最后得到的芝麻油澄清透明,油酸和亚油酸含量超过86%,过氧化值为0.15 mmol/kg,维生素E、芝麻素和芝麻林素含量分别为75.15 mg/100 g、6.03 mg/g和4.58 mg/g。破乳副产物的磷脂含量(干基)可达到120.08 mg/g。