论文部分内容阅读
目的:1.采用流式分析证实胰腺癌中SP细胞的存在,对SP细胞生物学特性进行检测,鉴定其干细胞特性;2.检测胰腺癌干细胞中Hh信号通路相关分子的表达,深入探讨Hh信号通路在胰腺癌的发生发展及其生物学特性的维持机制中的作用,对Hh信号通路靶向干扰的基因治疗研究提供实验依据;3.队列研究方法分析胰腺癌组织内Hh信号通路相关分子的表达与胰腺癌预后的相关性,以期为今后进一步研究胰腺癌复发转移机制、早期诊断方法、预后判断方法及新的治疗手段提供理论和实验依据。方法:1.应用Hoechst 33342染色,流式细胞仪分选5个胰腺癌细胞株中SP细胞后选择SW1990细胞,分选出的SP细胞为研究对象对其生物学特性进行检测;通过分析SP细胞与NSP细胞细胞周期、检测SP细胞分化能力、鉴定SP细胞异种成瘤能力、鉴定SP细胞表面标志物等方法来检测胰腺癌SP细胞肿瘤干细胞特性。2.分别用RT-PCR和Western blot法检检测Hedgehog信号通路成员RNA和蛋白在SW1990细胞、SW1990细胞分选所得SP细胞、Non-SP细胞及正常胰腺导管细胞中的表达;Smo siRNA片段设计与合成;携带Smo siRNA3慢病毒表达载体转染SW1990细胞分选的SP细胞后细胞生物学特性检测。3.采用队列研究的方法对此50例患者进行了预后相关因素的关联分析。结果:1.分选MIA Paca-2、CFPAC-1、BxPC-3、SW1990和Panc-1胰腺癌细胞株中SP各株细胞分选出SP细胞比例分别:0.592±0.087%、3.210±0.283%、0.074±0.018%、8.925±1.170%及5.332±0.743%,对照组加入维拉帕米后未见有SP细胞;SP细胞与非SP细胞(Non-SP cell)吸光度绘制生长曲线,比较无统计学差异;相较于Non-SP细胞,SP细胞处于G0-G1期的细胞比例较高而处于S期的细胞比例则较少(P<0.05);SP细胞具有与干细胞相同的分化能力;SP细胞仅需1×104个即可在裸鼠体内成瘤,而Non-SP细胞则需1×106个才可成瘤,证实SP细胞异种成瘤能力是Non-SP细胞的100倍;SP细胞中CD24+CD44+细胞比例为3.924±0.271%,CD133+细胞比例为84.728±11.241%,Non-SP细胞中CD24+CD44+细胞比例为0.827±0.035%,CD133+细胞比例为62.947±8.410%,与采用表面标志物分选胰腺癌干细胞相关文献报道相符,证实SP细胞富含胰腺癌干细胞。2.除Ptch1、Gli2和Bcl2在胰腺导管细胞中的表达高于sw1990细胞外,其余基因在sw1990细胞中的表达均明显高于胰腺导管细胞;仅有shh和smo在sp细胞中的表达明显高于sw1990细胞,其余基因在两组间表达未见明显差异;各组non-sp细胞中基因表达情况与sw1990细胞中表达未见明显差异。rt-pcr法检测经smosirna3慢病毒表达载体转染后sw1990细胞中smo基因的表达,转染后d1至d5抑制率分别为:-2.347%、0.784%、42.973%、73.448%及58.591%。3.rt-pcr扩增结果:shh、ptch1、smo、gli1mrna在胰腺癌组织中表达较胰腺癌旁组织表达明显增多(p<0.05);而以上四个内参β-actin的rt-pcr产物在各组中表达均无显著性差异(p>0.05)。临床病理特征的关系:中低分化胰腺癌组织shh、ptch1、smo、gli1mrna平均表达水平均高于高分化胰腺癌组织平均表达水平,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot实验结果:分别检测shh、ptch1、smo、gli1蛋白在胰腺癌组织中表达较胰腺癌旁组织表达均明显增多(p<0.05);以上四个成员内参β-actin蛋白表达在各组中表达无显著性差异(p>0.05)。临床病理特征的关系:中低分化胰腺癌组织shh、ptch1、smo、gli1蛋白平均表达水平均高于高分化胰腺癌组织shh、ptch1、smo、gli1蛋白平均表达水平,差异具有统计学意义(p<0.05);中低分化胰腺癌组织shh、ptch1、smo、gli1蛋白平均表达水平均高于高分化胰腺癌组织ptch1蛋白平均表达水平,差异具有统计学意义(p<0.05);以上四个蛋白表达与患者年龄、肿瘤直径、tnm分期、侵犯血管和神经、淋巴结转移无关(p>0.05)。预后因素的分析:单因素分析:22纳入个因素中,性别、分期、淋巴结转移、术后化疗、术后胰瘘发生及smo基因的高表达6个为显著性因素(p<0.05),将上述6个因素代入cox回归方程,结果示:分期、术后化疗和术后胰瘘的发生为影响术后患者预后的独立因素(p<0.05),其中分期、术后胰瘘的标准回归系数为正值,表明其与患者术后死亡呈正相关,而术后化疗为负值,说明其为胰腺癌患者术后预后的保护因素。结论:1.胰腺癌中的确存在sp细胞,其表型为cd133十和cd44+cd24-esa+,具有肿瘤干细胞的生物学特性。2.针对hh信号通路关键基因smo设计了3条sirna片段,成功构建了携带这3条片段的慢病毒表达载体,通过转染sw1990细胞后对smo表达的抑制率筛选出最为适于后续研究的smosirna慢病毒表达载体,这不仅为本研究后续研究的顺利开展奠定了良好的实验基础,也为针对hh信号通路靶向干扰的基因治疗研究提供了一定实验证据。3.shh、ptch1、smo、gli1mrna在胰腺癌组织中表达较胰腺癌旁组织表达明显增多,而且在低分化胰腺癌组织平均表达水平高于高分化胰腺癌组织平均表达水平;与患者年龄、肿瘤直径、tnm分期、侵犯血管和神经、淋巴结转移无关。shh、ptch1、smo、gli1蛋白在胰腺癌组织中表达较胰腺癌旁组织表达明显增多,以上四个蛋白在低分化胰腺癌组织中平均表达水平高于高分化胰腺癌组织平均表达水平;胰腺癌组织中蛋白表达与胰腺癌的分化程度显著有关,与患者年龄、肿瘤直径、tnm分期、侵犯血管和神经、淋巴结转移无关。影响胰腺癌预后的因素中分期、术后胰瘘与患者术后死亡呈正相关,而术后化疗为胰腺癌患者术后预后的保护因素。