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癌细胞的永生化是肿瘤生长和转移的关键，而端粒酶是维持癌细胞持续增殖的关键酶。目前发现约90%肿瘤细胞的端粒酶都有活性，而大多数正常细胞的端粒酶一般无活性。因此，端粒酶是一种十分有价值的肿瘤标志物，已成为化疗药物的新靶点。二氢吡唑类化合物已证实具有抗癌、抗炎及抗病毒等生物活性，但其作用机制未明。因此，本课题组计算机模拟、设计并合成81个靶向端粒酶活性亚单位hTERT的新型手性二氢吡唑类化合物作为潜在的端粒酶抑制剂。通过前期在前列腺癌PC3、乳腺癌Bcap-37及胃癌MGC-803细胞株筛选发现化合物10i、10n、11i、13i及13k抑制MGC-803细胞增殖作用较好，IC50值分别为3.51±0.21μM、3.01±0.13μM、2.02±0.23μM、2.96±0.15μM及1.41±0.17μM。其中，化合物13k的抗癌活性最高；另一方面其对人正常细胞GES-1和L-02的毒性较小，其IC50值在mM级别。而且，通过改良的TRAP实验发现化合物13k同时表现出很强的抑制端粒酶活性作用，其IC50值为0.86±0.05μM，以上结果提示化合物13k可能是一个高效、高选择性的潜在端粒酶抑制剂。另外，分子对接的2D和3D图提示13k靶向hTERT，并且加药组hTERT表达下调及端粒酶活性下降，进一步验证其靶向性。为了进一步探讨化合物13k靶向hTERT发挥抑制MGC-803细胞增殖作用的机制，首先通过流式细胞术检测细胞周期发现化合物13k处理48h后G0/G1期细胞数显著增多；且与空白对照组相比，cyclin D1表达减少，这提示化合物13k抑制细胞增殖是通过阻滞细胞于G0/G1期实现。其次，RT-PCR及Western blot检测发现化合物13k靶向hTERT能下调MGC-803细胞Wnt通路中关键分子β-catenin及下游与增殖相关的信号分子如c-Myc和cyclin D1mRNA和蛋白的表达，这提示化合物13k靶向hTERT能抑制MGC-803细胞增殖，与Wnt/β-catenin通路有关。再次，应用端粒酶抑制剂AZT、hTERT-siRNA沉默及pCI-neo-hTERT质粒转染等方法观察hTERT对Wnt/β-catenin经典信号通路的影响。RT-PCR和Western blot结果发现在MGC-803中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的水平能随着hTERT表达的下降而降低，反之亦然，即MGC-803中hTERT能直接调控Wnt/β-catenin经典信号通路。最后，化合物13k处理hTERT过表达的MGC-803细胞48h后，Westernblot结果发现与hTERT过表达组相比，加药后hTERT、β-catenin、cyclin D1及c-Myc表达均下降。综上所述，本课题组基于合理的药物分子设计的基础上设计并合成一系列新型手性二氢吡唑类化合物靶向hTERT，并从中筛选一个高效高选择性的潜在端粒酶抑制剂——化合物13k，并进一步探讨其作用机制。研究发现化合物13k靶向hTERT，抑制端粒酶活性和hTERT蛋白表达，从而阻滞细胞于G0/G1期，最终抑制MGC-803细胞增殖。同时发现这种作用是通过下调与细胞增殖活化相关的Wnt/β-catenin经典信号通路来实现的。