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石斑鱼(Epinephelus spp.)以其味道鲜美、营养丰富、肉质细嫩成为热带和亚热带地区最受欢迎的养殖品种之一。本课题组前期开展了褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus,♀)×清水石斑鱼(E.polyphekadion,♂)杂交育种研究,并成功完成杂交石斑鱼子一代的培育。该杂交石斑鱼在免疫应答、抗病力等方面的表现尚不清晰,本研究围绕杂交石斑鱼及其母本褐点石斑鱼在免疫应答方面的差异开展了以下研究:1、杂交石斑鱼和褐点石斑鱼免疫相关组织的转录组测序采用Illumina/Hiseq-2000 RNA-Seq技术对杂交石斑鱼[褐点石斑鱼(E.fuscoguttatus,♀)×清水石斑鱼(E.polyphekadion,♂)]和褐点石斑鱼注射polyI:C 24h后的脾脏和头肾进行RNA-seq测序。共得到62,238条高质量unigenes,平均长度为1,150bp,N50为2,499bp。功能注释结果显示,至少有27,305(43.94%)个unigenes在一个数据库中被注释,有11,622(23.07%)个unigenes在4个数据库中都被注释。根据差异基因筛选原则[基因的|log2(倍数变化)|≥1]和错误发现率(FDR)<0.05,筛选出47,920个差异表达基因(DEGs)。KEGG功能富集分析结果表明,差异表达基因(DEGs)富集到20条免疫相关的信号通路里,如RIG-I-样受体信号通路,NOD-样受体信号通路和Toll样受体信号通路。随机选出9个差异基因进行qRT-PCR验证,结果显示,这9个差异基因的表达趋势与转录组结果一致。基于转录组测序筛选出的差异表达基因数据,从中挑选出与免疫应答相关的模式受体基因(NLRX1、NLRP1、TLR9、NLRP3、NOD2和TLR5)、白细胞介素IL-1β和IRF3,开展基因的克隆及表达分析。2、免疫相关差异表达基因的表达分析(1)先天性免疫抵抗病原的入侵主要依赖于模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)对病原的识别,激活免疫反应,从而抵御外界病原的侵入。外周血淋巴细胞(PBL)由淋巴器官产生,是具有免疫识别功能的细胞系,也是机体免疫应答功能的重要细胞成分和开展免疫学研究的关键。为了解PRRs基因在杂交石斑鱼和褐点石斑鱼免疫应答中的作用。首先需要采集纯度高且足量的PBL,本研究首先利用不同Percoll浓度(15%、20%、25%、30%、35%)梯度密度离心法分离杂交石斑鱼的外周血淋巴细胞,通过血涂片的方法对血细胞中的不同细胞进行分类、统计。结果表明,浓度为25%的Percoll分离液收集的杂交石斑鱼淋巴细胞白膜层富集最明显,且PBL数量最多(85.56%),纯度最高(90%),活性最好(95%以上)。(2)为了检测免疫相关差异表达基因在PBL应对LPS和PolyI:C免疫过程中的表达情况,利用LPS和PolyI:C刺激PBL(25%浓度),检测免疫相关差异表达基因的时序性表达情况。结果显示,LPS和PolyI:C刺激PBL1h后,杂交石斑鱼的TLR2和TLR9基因表达量在LPS刺激后无明显差异;褐点石斑鱼中只有NLRX1基因和IL-1β基因表达量在PolyI:C刺激后无明显区别。(3)为了解IRF3基因在杂交石斑鱼应对外源病毒刺激的免疫应答中的作用,本研究利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆了杂交石斑鱼IRF3基因并分析其在PBL中的表达情况。结果表明,该基因cDNA全长为2529bp,包含5’非编码区(5’-UTR)325bp,3’非编码区(3’’UTR)916bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)1377bp,可编码458个氨基酸。氨基酸序列包含N-末端DNA结合区(DBD)(1-108aa)、1个C-末端干扰素相关区(IAD)(255-435aa)以及色氨酸富含区(SRD)3个结构域。系统进化分析结果显示,杂交石斑鱼IRF3与花鲈(Lateolabrax maculatus)IRF3聚为一支,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR检测了IRF3基因在杂交石斑鱼肝、胃、鳃、肠、脾脏等9种组织的表达情况,结果显示,IRF3基因在9种组织中均有表达,肝、胃、肠中的表达量明显高于其他组织,头肾表达量最低。此外,PBL在PolyI:C刺激1h后,IRF3基因表达量逐渐升高,4h时表达量达到最大值(约为对照组的9.3倍),8h后逐渐下降。3、PolyI:C和LPS刺激对杂交石斑鱼PBL中三种酶活力的影响利用PolyI:C和LPS分别刺激PBL,并在0h、1h、4h、8h和12h分别测定ACP、AKP和CAT的活力。结果显示,PBL经PolyI:C刺激后,ACP和AKP两种水解酶的活力都显著高于对照组(0h),但CAT活力无明显变化;PBL经LPS刺激后,ACP、AKP和CAT三种水解酶的活力都显著高于对照组(0h);