在2012年,膀胱癌是一种在世界排名第九的恶性肿瘤,每年大约有430,000的患者被确诊患有膀胱癌,导致大约165,000名患者死亡。虽然根治性膀胱切除术并辅以新辅助化疗作为膀胱癌的标准治疗方式,患有侵袭性和转移性膀胱癌的患者5年生存率仍然很低。因此,迫切需要发现新的治疗策略,在保证安全性的同时,延长患者的存活时间并改善生活质量。姜黄素（1,7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮）是从姜黄根茎分离的天然多酚化合物,在许多亚洲国家被用作食品添加剂或许多传统医药佐剂超过2000年。以前的研究表明,姜黄素在体外和体内具有各种生理和药理特性,包括抗氧化,抗菌,抗炎,免疫调节,自由基清除和抗糖尿病活性。姜黄素通过调节各种分子靶标和细胞信号传导途径,显示出潜在的抑制癌细胞增殖,诱导凋亡,诱导癌细胞周期停滞和抑制多种癌症中的血管生成的作用。此外,姜黄素能够诱导细胞凋亡和细胞周期停滞,并抑制膀胱癌细胞的增殖。姜黄素在治疗肿瘤时,具有药理学安全和有效的优点,使其成为潜在的可用于治疗肿瘤的药物,但其具有有效性不够强大,吸收效率不高,代谢快的缺点,并且高剂量姜黄素的使用由于出现副作用而应用受到限制。因此,其与其它抗肿瘤试剂,特别是与天然抗肿瘤化合物的组合应该被更多的研究,并且这种组合的基本分子机制也应当更好地研究,以实现提高姜黄素的效力。褪黑素是松果体在脊椎动物中的主要分泌产物,调节昼夜节律,睡眠,情绪,繁殖和其他生物过程。在过去的几十年中,体外和体内研究已经证明褪黑激素具有各种生理和药理活性,包括抗增殖,抗血管生成,抗炎,抑制肿瘤转移和诱导细胞凋亡,并影响多种信号通路,包括NF-κB信号通路。基于其对多种生理功能的贡献及其极少的副作用,把褪黑素作为其它化疗药的联合用药值得尝试以形成新的癌症治疗策略,同时减小化疗药带来的副作用。环氧合酶-2（COX-2）是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶,与炎症的进展有关,且某些刺激因素,如生长因子和细胞因子可诱导其合成,同时,其与许多人类癌症的发生有关。以前的研究表明,COX-2蛋白在广泛的人类癌症（包括膀胱癌中高度）中广泛表达,与肿瘤高侵袭性和患者较差的预后相关。COX-2的转录受反式激活因子（如NF-κB）的调控,NF-κB通过结合到其启动子进行调节。因此,抑制COX-2的表达可能是抑制膀胱癌发展的有效替代方法。然而,姜黄素是否可以调节COX-2表达以及褪黑素是否可以敏化或增强这种调节以进一步抑制膀胱癌细胞生长仍然不清楚。本课题旨在探讨褪黑素能否增强姜黄素对膀胱癌的抗肿瘤作用,并且进一步探讨其机制。为了检验这一假设是否成立,我们分析了姜黄素和褪黑激素对膀胱癌细胞细胞增殖,迁移和凋亡的组合效应。接下来,还分析了一些关键蛋白的变化,以揭示这种组合模式的基本分子机制。我们的研究表明,褪黑激素可用作潜在的组合剂,敏化姜黄素的抗肿瘤作用。这种敏化作用是通过同时调节多种信号途径介导的,这意味着这种组合治疗可能潜在地成为有效地膀胱癌治疗方式。实验目的:姜黄素（curcumin,Cur）是一种天然多酚化合物。在亚洲的许多国家中,其作为食物添加剂和传统药物的佐剂已经有2000多年的历史了。褪黑素（Melatonin,Mel）是由哺动物和人类的松果体产生的一种具有多种生理功能的吲哚胺类激素。姜黄素和褪黑素在多种肿瘤的研究中能够有效地抑制肿瘤的增值。姜黄素和褪黑素联合使用在对膀胱癌的治疗中从未被研究过,其作用的机制更是知之甚少。在我们的这个实验中,我们研究姜黄素和褪黑素联合使用是否能够增强对膀胱癌细胞的抑制作用,并且研究其作用机制。实验方法:在本实验中,采用MTT法检测不同浓度褪黑素和姜黄素分别及联合使用处理人膀胱癌细胞T24、UMUC3、5637后的细胞活力。通过细胞迁移实验,transwell实验,细胞集落形成实验和细胞凋亡检测,研究褪黑素和姜黄素对膀胱癌抑制作用的生物学功能。在分子机制研究中,运用激光共聚焦免疫荧光技术,DNA-蛋白质相互结合Pulldown分析方法,研究褪黑素和姜黄素单独及联合作用于膀胱癌细胞对转录因子NF-κB p50/p65的核定位及它们结合到COX-2启动子区域变化的影响。为了寻找姜黄素和褪黑素联合使用的作用靶点,本实验采用细胞IKKβ激酶活性光度法定量检测及western blot方法检测经过褪黑素和姜黄素单独及联合处理后,细胞IKKβ激酶活性及细胞蛋白质水平的变化。同时,我们做了膀胱癌T24细胞裸鼠移植瘤实验,观察了褪黑素和姜黄素单用及联合使用后,对移植瘤的影响,并用免疫组化分析了相关蛋白的表达情况。实验结果:姜黄素和褪黑素联合使用能够有效地抑制膀胱癌细胞COX-2的表达,其机制为作用于IKKβ,抑制其磷酸化,从而抑制NF-κB结合到COX-2的启动子区,影响转录和翻译过程。此外,姜黄素和褪黑素联合使用还能通过促进细胞色素c从线粒体膜间隙释放到细胞质中,从而引起膀胱癌细胞的凋亡。实验结论:本研究发现褪黑素能够显著增强姜黄素对膀胱癌细胞中COX-2表达的抑制作用,其作用机制为抑制IKKβ/NF-κB信号通路。本研究表明,姜黄素和褪黑素联合使用具有潜在的应用价值,其能够成为一种有效地治疗膀胱癌的方案。