【摘 要】
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klf4作为诱导iPS细胞的转录因子已成为研究领域的热点,其在调控细胞增殖、分化、胚胎发育等生命过程中均发挥重要作用。为了探讨klf4过量或降低表达对肝脏再生的作用,本文以大鼠再生肝为材料,参照klf4的mRNA序列信息设计克隆引物和带酶切位点引物,采用分子克隆技术得到klf4的克隆载体,测序证实正确后,以其为模板,进一步将基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建出表达载体pEGFP-N1-
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klf4作为诱导iPS细胞的转录因子已成为研究领域的热点,其在调控细胞增殖、分化、胚胎发育等生命过程中均发挥重要作用。为了探讨klf4过量或降低表达对肝脏再生的作用,本文以大鼠再生肝为材料,参照klf4的mRNA序列信息设计克隆引物和带酶切位点引物,采用分子克隆技术得到klf4的克隆载体,测序证实正确后,以其为模板,进一步将基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建出表达载体pEGFP-N1-klf4;另外,同样参照klf4的mRNA序列信息,利用锐博、Genesil、Ambion和QIAGEN等网站的在线设计工具,查阅siRNA设计相关论文,针对klf4 mRNA的2个区域合成寡聚核苷酸片段连接到干涉载体pGenesil-1.0上,构建出2个干涉klf4 mRNA的干涉载体pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082;同样,双酶切表达载体pEGFP-N1-klf4得到klf4的ORF,将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-k814和pGenesil-1.0-k1082上,构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4。测序证实正确后,将klf4构建到干涉载体中,完成干涉载体对应检验载体pGenesil-1.0-k814-klf4和pGenesil-1.0-k1082-klf4的构建;利用构建的klf4的表达载体、干涉载体和检验载体,采用尾静脉液压转基因法,分别将构建的3组载体注入大鼠体内,荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术检测转klf4后大鼠死亡率、肝指数和肝组织形态结构的变化。经测序和电泳检测证实,本论文成功构建了klf4的表达载体、干涉载体和检验载体。运用尾静脉液压转基因法进行klf4基因添加或RNA干涉研究klf4在大鼠肝再生中作用发现,目的质粒的肝内表达动力学与载体作用检测结果一致,说明目的片段成功表达。转入pEGFP-N1-klf4质粒后大鼠死亡率正常,肝指数在120h略有升高,肝组织的显微结构无明显变化。转入pGenesil-1.0-k814、pGenesil-1.0-k1082质粒后,大鼠死亡率明显高于正常范围,肝指数在120h略有上升、168h略有下降,肝组织的显微结构无明显变化。本文克隆了klf4基因,构建其表达载体、干涉载体和检验载体,根据体内检测结果初步判断klf4与大鼠肝脏再生有关。本文积累的研究经验与数据将为今后对klf4与肝再生的进一步研究提供重要的参考和指导。
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