研究背景流行性感冒病毒（简称流感病毒）是经急性呼吸道传播的流感致病因子,属于RNA病毒的正粘病毒科,分为甲、乙、丙三型。其中甲型流感病毒最为常见,同时造成的危害也最大。甲型流感病毒根据血凝素（H）和神经氨酸酶（N）抗原不同,又分为许多亚型,H可分为16个亚型（H1-H16）,N有9个亚型（N1～N9）。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类,其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下,禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5N1人禽流感感染病例,其中6例死亡,引起全球广泛关注。1997年以后,世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。特别是今年3月底在我国上海和安徽两地率先发现一种新型流感病毒,称为H7N9型禽流感,是全球首次发现的新亚型流感病毒。目前,科学家最新发现H7N9病毒正在向适合感染哺乳动物方向发展,这使病毒更容易感染到人。具有高致病性的H5N1、 H7N7、H9N2等禽流感病毒,一旦变异而具有人与人的传播能力,会导致人间禽流感流行,预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。在历史上,曾发生过多次世界范围的流感大流行,仅第一次世界大战期间就有2000万人死于流感。2004年席卷东南亚的H5N1高致病性禽流感的流行使出现疫情的国家和地区经济损失惨重,同时也让人们清醒地认识到流感的控制和预防是整个世界有待解决的严重问题。流感作为严重威胁公众健康的病毒性传染病,防治形势很不乐观。从治疗上讲,目前临床上只有两类药物,其中M2离子通道阻滞剂金刚烷胺和金刚乙胺已基本产生耐药。另一类神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦（达菲）和扎那米韦两种,抑制新生病毒的释放和感染其它细胞。这一类药物对H5N1型禽流感和甲型H1N1流感具有较好疗效,但目前已从多个病人中分离到达菲耐药株。扎那米韦的口服生物利用度低,只能注射,限制了其对流感的防治应用和效果。积极研究防治流感病毒的药物,尤其是新作用机制的药物,不仅是当前医学界面临的挑战,也是关乎社会经济发展的重要课题。作用于流感病毒包膜血凝素蛋白的病毒进入抑制剂,是一类新机制的抗流感药物,已成为当前研究的热点。目前研究发现,很多黄酮、鞣酸、生物碱及萜类化合物具有不同程度的抗流感作用,因此天然来源的单体化合物是抗流感药物的重要来源。目前,抗流感病毒天然药物在我国临床已有广泛应用,特别是毒副作用相对低,不易诱导耐药性产生的优点而倍受关注。天然药物在抗流感病毒方面具有得天独厚的优势和广阔的发展前景。广东地处岭南,有丰富的岭南药用植物资源,且很多是具有清热解毒或具有抗病毒效果的中药材。这些岭南药用植物中含有丰富的黄酮、鞣酸、生物碱及萜类化合物。由金银花、黄芩、连翘三味药材组成的著名方剂为双黄连口服液,双黄连制剂在2005年被卫生部列入其官方发布的《人禽流感诊疗方案》之中。此外,在卫生部《甲型H1N1流感诊疗方案（2009年第三版）》提出的中医防治甲流的方案中,双黄连口服制剂是重点推荐的药品之一。双黄连口服液含有多种抗病毒成份,具有辛凉解表、清热解毒功效。通过预实验研究发现双黄连制剂可以抑制H5N1假病毒的活性,为此,我们针对金银花、黄芩、连翘三个药材的主要成分,如：绿原酸、木犀草素、木犀草苷；黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷；连翘苷、连翘酯苷、槲皮素、金丝桃素、芦丁等天然产物进行抗流感病毒研究,旨在筛选出能够有明显抗流感活性的单体化合物,,并进行相关机制研究,进一步揭示其抗流感密切相关的效应成分,促进中药现代化。多酚类化合物为具有数个酚羟基的天然化合物,在很多药用植物中含量丰富、种类繁多。多酚类化合物在药物开发方面显示了良好的前景。近年来,对茶多酚类化合物抗流感病毒的作用的研究日益加深。2006年美国FDA批准了第一个新植物药Veregen,用于治疗外生殖器和肛周疣,其中的活性成分即为儿茶素类多酚化合物。茶黄素衍生物是红茶中的主要成分。它们是一类具有苯骈卓酚酮结构的物质。目前已发现并鉴定的茶黄素种类共有28种,其中茶黄素（Theaflavin或TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-Gallate或TF2A）、茶黄素-3’-没食子酸酯（Theaflavin-3’-Gallate或TF2B）和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(（Theaflavin Digallate或TF3）是4种最主要的茶黄素。目前国内外大量研究证实其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗增殖等作用,是一类极具开发潜力的天然产物。我们课题组曾报道TF（含有四种茶黄素,含量为90%）具有广谱的抗HIV活性,可通过多种机制抑制HIV的复制,为多靶点的HIV进入抑制剂。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）是绿茶中含量最高的成分,占绿茶儿茶素类总量的10%-15%,它是2-连苯酚基苯骈毗喃与没食子酸形成的酯,同时,因其结构中有6个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素类化合物的许多性质。EGCG具有多种生物活性而备受关注,尤其对EGCG抗流感病毒的作用的研究日益加深。我们的前期研究已证明EGCG和EGCG衍生物能够通过抑制gp41六螺旋束核心结构的形成而阻止HIV病毒的进入。流感病毒与HIV类似,均为Ⅰ型包膜病毒。为此,我们对茶叶中主要茶多酚TF和EGCG进行抗甲型流感活性系列研究。目的和意义：病毒进入抑制剂能在感染的早期阶段起阻断作用,具有高效、特异的特点,是近年来抗病毒药物研究的热点。本研究是从具有抗流感活性的天然产物中分离流感病毒进入抑制剂。主要研究内容包括：1、双黄连口服制剂是我国重点推荐的抗流感中药之一,该著名方剂主要由金银花、黄芩、连翘三个主要药材组成。本研究分析三个药材所含主要成分的抗流感活性,旨在发现能抑制流感病毒进入靶细胞的活性单体化合物,有望从流感防治中药中发现新机制的小分子抗流感药物,实现中药药效物质基础辨识的目标。2、多酚类化合物在药物开发方面显示了良好的前景。近年来,对茶多酚类化合物抗流感病毒的作用的研究日益加深。本文对茶叶中主要茶多酚TF和EGCG的抗甲型流感活性和作用机理进行了研究,为甲型流感病毒感染的预防和治疗提供依据。方法：1.建立细胞水平的H5N1假病毒活性检测方法：将H5N1病毒包膜蛋白质粒（HA与NA）或者VSVG质粒与缺失Env蛋白和Vpr蛋白基因并插入绿色荧光蛋白基因的一个重组的骨架质粒pNL4-3R-E-Luc共同转染到293T细胞后,可分别获得H5N1假病毒和VSVG假病毒。2.抗H5N1假病毒活性筛选：应用MDCK细胞作为筛选模型,利用假病毒体系来研究金银花、黄芩和连翘三个主要药材抗流感密切相关的效应成分以及TF、EGCG的抗流感活性。3.活性化合物抗H5N1流感病毒作用位点的研究：利用血凝抑制实验研究化合物的作用位点是否为H5N1病毒包膜上血凝素蛋白的HA1亚基；利用神经氨酸酶抑制实验研究化合物的作用位点是否为H5N1病毒包膜上的神经氨酸酶（NA）。4.利用H1N1FM₁活病毒筛选金银花、黄芩和连翘三个主要药材抗流感密切相关的效应成分以及TF、EGCG的体外抗H1N1流感活性。5.采用MTT法进行化合物毒性评价。结果：1、由于制备的H5N1和VSVG假病毒中pNL4-3R-E-Luc带有绿色荧光蛋白报告基因,当假病毒成功感染MDCK细胞后,绿色荧光蛋白在MDCK细胞内表达。假病毒的感染能力可以通过荧光的化学发光值体现。2倍病毒原液稀释时H5N1假病毒的化学发光值可以达到107,而VSVG假病毒的化学发光值也可以达到106,表明制备的假病毒具有很强的感染能力。2、双黄连口服液能够特异性的抑制H5N1假病毒感染。3、金银花、黄芩和连翘三个主要药材所含主要成分绿原酸、黄芩素、黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷、槲皮素均有一定的抗H5N1活性,半数抑制浓度（IC50）分别为黄芩苷为0.034±0.0014mg/ml,黄芩素为0.209±0.028mg/ml,连翘酯苷为0.347±0.018mg/ml,连翘苷为0.531±0.195mg/ml,绿原酸为0.097±0.048mg/ml,槲皮素为0.112±0.0l mg/ml。4、TF和EGCG均能明显的抑制H5N1假病毒活性,它们的半数抑制浓度（IC50）分别为0.152±0.0189mg/ml和0.029±0.0018mg/ml。5、血凝抑制实验结果显示绿原酸和槲皮素可以与血凝素蛋白HA1结合,而TF、EGCG、木犀草素、木犀草苷；黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷；连翘苷、连翘酯苷、金丝桃素、芦丁在浓度很高的情况下没有发现明显的血凝抑制现象。6、神经氨酸酶抑制实验结果显示绿原酸、黄芩苷、连翘酯苷、槲皮素、TF和EGCG可以与神经氨酸酶结合。7、TF、EGCG以及双黄连口服液三种主要药材的主要有效成分对VSVG假病毒均没有抑制作用。8、TF、EGCG、黄芩素、黄芩苷、木犀草素可以抑制H1N1FM₁的活性。9、细胞毒性实验（MTT）显示：绿原酸、黄芩素、黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷、槲皮素、TF和EGCG在具有抗病毒活性的浓度时,对MDCK细胞没有明显的细胞毒性。结论：1、金银花、黄芩、连翘中绿原酸、黄芩素、黄芩苷；连翘苷、连翘酯苷、槲皮素具有明显的抗流感活性,并且绿原酸和槲皮素可以同时作用于病毒的HA1和NA靶点；连翘酯苷、黄芩苷可以抑制神经氨酸酶的活性；而黄芩素、连翘苷发挥抗流感活性的作用可能与抑制病毒HA2的活性有关。2. EGCG对源自A/Thailand/Kan353/2004的H5N1假病毒毒株有明显的抑制作用,但对VSVG假病毒没有抑制活性。由于两种假病毒仅是包膜蛋白不同,表明EGCG可特异性作用于H5N1流感病毒的包膜蛋白,即血凝素或神经氨酸酶。EGCG抑制流感病毒进入的作用位点可能在血凝素HA2,并在一定程度上抑制神经氨酸酶（NA）的活性,说明EGCG是通过多靶点作用而发挥抗H5N1亚型禽流感病毒的作用。3、TF在体外具有明显的抗H5N1假病毒作用,说明TF抗H5N1假病毒的靶点为血凝素蛋白或神经氨酸酶。TF抑制流感病毒进入的作用位点可能在血凝素HA2,同时可以抑制NA的活性,说明TF是通过多靶点作用而发挥抗H5N1亚型禽流感病毒的作用。4、TF、EGCG、黄芩素、黄芩苷均能不同程度地抑制流感病毒A/FM1/1/47（H1N1）增殖。