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热休克蛋白27(Heat shock prote in 27, HSP27)是小热休克蛋白家族最重要的成员之一,其生理功能主要包括保护细胞免受各种应激因素如自由基、高温、缺血和毒性物质的损伤,促进蛋白质的正确折叠、组装,参与细胞的发育,增殖、分化及细胞凋亡的信号调节和肌动蛋白丝重建等。有关HSP27在各种信号通路的调节作用得到了广泛的研究,但是对于HSP27磷酸化修饰的意义目前还不十分明确。本课题对HSP27以其磷酸化形式在细菌脂多糖(LPS)引起的炎症反应中以Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)为靶点所起的调控作用进行了研究。首先,延续本实验室之前的研究方向,本研究确认了HSP27在LPS引起的炎症反应过程中有磷酸化激活。在初步探索实验中,我们发现HSP27人单核细胞型淋巴瘤细胞株THP1中高表达,在LPS刺激下Ser15位和Ser78位在2小时内有一个显著的磷酸化和去磷酸化的过程。我们随后使用三方面的手段控制HSP27的磷酸化：一是使用抑制剂,包括特异性HSP27磷酸化抑制剂KRIBB3和HSP27上游激酶p38 MAPK的抑制剂SB203580；二是对HSP27的直接上游激酶MK2(丝裂活化蛋白激酶活化蛋白激酶.2,MAP kinase-activated protein kinase 2, MAPKAPK2)进行RNA干扰(RNA interference, RNAi),削弱HSP27的磷酸化；三是使用HSP27的三个主要磷酸化位点的突变质粒HSP27-3D(S15/78/82D),在细胞中过表达模拟磷酸化形式的HSP27。在THP.1细胞中,使用抑制剂(KRIBB3和SB203580)和MK2 RNAi可以显著的抑制细胞炎症因子的释放,并且影响了指标性的炎症相关酶iNOS和COX-2的蛋白表达。此外,在使用了这两种抑制HSP27磷酸化的处理后,在LPS刺激的情况下,以NF-kB和IRF3的激活分别为标志的TLR4下游MyD88依赖型和MyD88非依赖型/TRIF依赖型两条通路均被下调。使用TLR3的刺激源poly(IC)刺激THP1细胞后我们发现通过TLR3激活的IRF3激活无法通过抑制HSP27磷酸化而被抑制。在LPS刺激后单核/巨噬细胞的吞噬功能会加强,吞噬能力是在细胞水平反应炎症反应强度的一个标志。本研究使用荧光乳胶颗粒和荧光偶联LPS结合激光共聚焦和流式细胞术等手段发现了KRIBB3和SB203580可以削弱细胞吞噬能力。为了在整体水平上验证HSP27磷酸化对炎症的调控,我们建立了内毒素休克模型检测KRIBB3对急性炎症的治疗效果,实验中发现KRIBB3可以显著增加内毒素休克小鼠的存活率,表明抑制HSP27的磷酸化对于细菌感染性炎症确有一定的治疗作用。由于在细胞和整体模型水平上,我们均发现了抑制HSP27的磷酸化都能明显削弱炎症反应,我们进一步研究HSP27的磷酸化调控炎症反应的机制。既然控制HSP27磷酸化可以同时影响LPS引起的MyD88依赖型的和MyD88非依赖型的两条通路,抑制HSP27又不能显著抑制TLR3激活的MyD88非依赖型通路,说明其作用靶点处于信号通路上游位置。此外有报道细胞吞噬能力与外界病原对应的细胞表面TLRs的表达水平密切相关,考虑抑制HSP27也能抑制吞噬,故我们将研究方向落在了LPS的受体TLR4和TLR2之上。流式细胞术的结果证明了TLR2的膜分布在LPS刺激后变化不大并且也与HSP27磷酸化抑制剂没有显著联系。而LPS刺激下TLR4经历了膜定位上调后下降的趋势,KRIBB3和SB203580则可以去除这种趋势。根据已有报道,高尔基体是TLR4除了细胞膜外的另一个胞内聚集区室,也是趋向细胞膜的转运发生前所在的位置。我们使用了高尔基体特异性标记抗体进行激光共聚焦检测,发现TLR4在LPS后从高尔基体的趋膜转运可以被抑制剂阻断,与流式细胞术的结果相一致。同时我们通过免疫荧光和激光共聚焦手段,发现THP1细胞在接受LPS刺激后,胞内分散分布的HSP27有部分向高尔基体聚集的现象,这与已有报道的在其他炎症细胞系(小鼠巨噬样细胞J774.1)中的观察结果一致,在时间上略早于TLR4膜表面水平上调。结合前文结果,暗示抑制HSP27的磷酸化可以影响到由高尔基体起始的TLR4的转运和趋向细胞膜的分布,这可能是HSP27在上游调节TLR4通路的原因所在。在进一步的研究中使用免疫沉淀的方法证明了HSP27与TLR4在胞内可以形成复合体,在LPS刺激之后与TLR4结合增多。通过转染磷酸化突变体检测外源HSP27与TLR4的结合,又采取了新颖的二次串联IP实验方法辅证,我们发现了HSP27是以其磷酸化形式与TLR4结合并发挥作用的。此外为了研究更为细节的调控本质,本研究做了TLR4糖基化研究的初探,因为TLR4由高尔基体向膜上定位的过程必须经过一个糖基化成熟的过程,有意思的是我们发现了HSP27磷酸化抑制剂KRIBB3可以部分的抑制TLR4的糖基化过程。综上所述,本研究首次揭示了磷酸化形式的HSP27参与调节了LPS引起的炎症反应；在国际上首次提出了HSP27的磷酸化通过影响TLR4的糖基化调控其成熟与转运这一种全新的调控机制。这些结果对深入研究HSP27在细菌感染性炎症反应的地位和以HSP27的磷酸化为抗炎靶点进行药物开发具有重要的指导意义。