人脐带MSCs源microvesicles的分离及特异microRNAs检测

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背景微粒体(Microvesicles, MVs)是多种细胞释放在微环境中的质膜囊泡。近年来人们关注到细胞源MVs作为细胞间一个新的分子通讯介质,能够转运大量生物活性分子。目的分离人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)源MVs,检测特异性microRNAs表达,探讨MSCs潜在的细胞通讯方式。方法1.组织块培养法分离培养人脐带MSCs,进行传代扩增;从人脐带MSCs条件培养基(conditioned medium, CM)中提取MVs。2.对第3代MSCs细胞标记CD29-PE、CD44-APC、CD34-FITC、CD45-PerCP,流式细胞仪分析鉴定。3.TRIzol法提取细胞人脐带间充质干细胞及MVs中总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测miR-100和miR-21的表达水平,以U6作为内参对照。结果1.细胞形态呈长梭形,原代培养12d、传代培养4d细胞融合度达90%,细胞排列成漩涡状。2.人脐带间充质干细胞不表达造血细胞标志CD34(0.87%)、CD45(1.28%),强表达β1-整合素CD29(96.68%)、基质受体CD44(92.78%)。3.miR-100在正常培养MSCs、MVs、冻存MSCs中均能检测到表达。其中miR-100在MVs和正常培养MSCs中表达量无明显差异(P>0.05),miR-100在冻存MSCs中表达量显著低于正常培养MSCs (P<0.05).4.miR-21在正常培养MSCs、MVs、冻存MSCs中均能检测到表达。其中miR-21在MVs中表达量较正常培养MSCs中明显提高(P<0.05),miR-21在冻存MSCs中表达量显著低于正常培养MSCs (P<0.05)。结论1.从人脐带组织中成功分离培养MSCs,收获大量经过生物学鉴定的MSCs。2.从脐带MSC-CM中分离提取出MVs,在MVs中可以检测到miR-100、miR-21特异表达。3.在MVs中microRNAs呈现特异性富集;冻存MSCs较正常培养MSCs的microRNAs含量显著降低。
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