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目的1:从健康成人外周血中分离获取内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC),并探索EPC体外扩增所需的条件。方法:密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,接种在人纤维连接蛋白包被培养板,用含VEGF的培养液培养7天,收集贴壁细胞,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPC。结果:从成人外周血可分离获得EPC;激光共聚焦显微镜可成功鉴定EPC:VEGF和人纤维连接蛋白对该细胞的生长有促进作用。结论:外周血EPC的分离获取及其体外扩增条件的初步认识,为EPC的进一步研究及临床应用奠定了基础。
目的2:观察高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPC)数量和功能的变化。方法:选择高胆固醇血症患者和非高胆固醇血症患者各20例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板,培养7天后贴壁细胞进行细胞化学分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-□和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC。采用MTT比色法、改良的Boyden小室和粘附能力测定实验观察EPC的增殖、迁移和粘附能力。结果:高胆固醇血症患者外周血EPC数量明显减少(41.8±8.7vs64.5士16.6EPCs/×200视野,P<0.05),且EPC数量与血总胆固醇水平(r=-0.659,P<0.001)和LDL胆固醇水平(r=-0.611,P<0.001)呈反向线性关系。高胆固醇血症患者EPC的增殖、迁移和粘附能力也明显受损。结论:高胆固醇患者外周血内皮祖细胞数量减少、功能减退。
目的3:观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)数量和功能的影响。方法:密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞并加入不同浓度ox-LDL(分别为25μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL)和LDL(100μg/mL)培养一定的时间(6h,12h,24h以及48h)。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPC,分别观察EPC的增殖、迁移、粘附和体外血管生成能力。结果:Ox-LDL显著减少外周血EPC数量,200μg/mLox-LDL作用24小时对EPC数量的影响最为显著(较对照组减少了近70%,P<0.001)。另外,100μg/mLox-LDL呈时间依赖关系减少EPC数量,于24h达到高峰(P<0.01)。Ox-LDL也显著损害了外周血EPC的粘附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论:Ox-LDL可减少EPC数量并损害EPC功能。