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【背景】结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。由于早期结直肠癌患者缺乏典型症状,多数患者就诊时已发生远处转移。晚期结直肠癌患者治疗效果不佳,五年生存率只有10%。因此对于中晚期结直肠癌患者,亟需一种或多种肿瘤标志物来判断肿瘤的预后或预测肿瘤的治疗疗效以指导患者用药,以期真正达到肿瘤的个体化治疗。Ras相关核蛋白Ran是我们前期通过相关实验发现,能够和Txl-2b相互作用的蛋白质。Ran在正常细胞的物质核浆转运和有丝分裂中发挥着重要作用。近年来研究发现,Ran在大多数肿瘤中高表达,并且可以促进肿瘤的一些恶性表型的发生,例如促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制肿瘤细胞的凋亡,诱导肿瘤细胞耐药等,但是其促瘤机制目前尚不完全清楚。【目的】1.检测Ran在结直肠癌组织和细胞中的表达。2.构建Ran的下调及过表达细胞模型。3.观察Ran对结直肠癌细胞增殖凋亡能力的影响。4.观察Ran对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响。5.探讨Ran促进结直肠癌恶性表型发生的分子机制。【方法】1.检测Ran在结直肠癌组织和细胞中的表达1)IHC检测Ran在结直肠癌组织芯片中原发灶、癌旁组织及转移灶中的表达,分析Ran在正常组织、原位癌组织和转移灶中表达强度的差异。2)Western blot及实时定量荧光PCR检测正常肠上皮细胞及多种结肠癌细胞株Ran的蛋白及RNA水平,并筛选出适合构建细胞模型的细胞株。2.构建Ran的下调及过表达细胞模型1)细胞瞬时转染Ran-si RNA Oligos并验证其干扰效率。2)Ran-sh RNA慢病毒感染HCT116及DLD-1细胞系构建Ran下调细胞模型并验证其干扰效率。3)Ran-sg RNA慢病毒感染HT29及SW480细胞系构建Ran过表达细胞模型并验证其过表达效率。3.Ran对结肠癌细胞增殖凋亡能力的影响1)CCK8法在Ran的干扰和过表达细胞模型中检测肿瘤细胞增殖能力。2)流式细胞技术检测Ran-si RNA Oligos转染后肿瘤细胞的凋亡。3)Western blot检测Ran-si RNA Oligos转染后caspase-3和PARP的改变。4.Ran对结肠癌细胞转移能力的影响。1)Transwell实验在体外检测Ran的干扰和过表达细胞模型中结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。2)裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞配合小动物活体成像技术检测Ran下调细胞模型的体内转移能力。5.Ran促进结肠癌恶性表型发生的分子机制1)Western blot检测Ran干扰和过表达的细胞模型核浆蛋白中p53、β-catenin、NF-κB、EGFR以及总蛋白中EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK的表达。2)实时定量荧光PCR检测Ran过表达细胞模型中EGFR的表达。3)免疫荧光检测Ran下调后DLD-1细胞中Ran和p-EGFR的表达。【结果】1.在45例结直肠癌原发灶组织、34例癌旁组织、51例转移灶组织中,Ran在结直肠癌原发灶中的表达明显高于癌旁组织(P=0.02),差异具有统计学意义。而Ran在结直肠癌转移灶中的表达明显高于原发灶(P=0.0008),差异具有统计学意义;实时定量荧光PCR和Western blot分别检测Ran在结直肠癌细胞中m RNA和总蛋白水平的表达情况。结果显示:无论是在m RNA水平或总蛋白水平,Ran在结肠癌细胞中的表达明显高于正常肠上皮细胞HIEC。2.si RNA转染HCT116和DLD-1细胞系,实验组Ran蛋白水平表达量均明显低于阴性对照组。HCT116细胞中,si-1和si-2在20 n M时抑制效果最好,抑制效率均大于70%。DLD-1细胞中,虽然抑制效率不如HCT116,但同样是si-1和si-2在20 n M时抑制效果最好,抑制效率均大于50%。故选择si-1干扰序列包装慢病毒进行后续实验,且将体系中si RNA终浓度优化为20 n M;实时定量荧光PCR和Western blot结果显示:在HCT116和DLD-1中,与对照组相比,实验组Ran的m RNA水平分别下调了71%和59%。并且与对照组相比,Ran在蛋白水平也有较为明显的下调。Ran的下调细胞模型构建成功。而在SW480和HT29中,与对照组相比,实验组Ran在m RNA水平分别上调了3.5倍和3.7倍。并且与对照组相比,Ran在蛋白水平也有明显的上调。故Ran的过表达细胞模型构建成功。3.在HCT116和DLD-1的Ran下调细胞模型中,与对照组相比,从第3天开始,HCT116实验组细胞生长速度显著降低;从第2天开始,DLD-1实验组细胞生长速度显著降低,结果具有统计学差异。在SW480和HT29的Ran过表达细胞模型中,与对照组相比,两种细胞均从第5天开始,实验组细胞生长速度显著加快,结果具有统计学差异。4.HCT116和DLD-1细胞si-1组早期凋亡率较NC组增加,晚期凋亡率si-1组、si-2组晚期凋亡率较NC组显著增加;si-1组和si-2组与NC组相比,caspase-3表达无显著变化,cleaved caspase-3表达水平显著升高。PARP表达有所下降,cleaved PARP表达显著升高。5.体外实验结果表明,在Ran的下调细胞模型中,与对照组相比,HCT116和DLD-1细胞的迁移和侵袭能力均明显减低。在Ran的过表达细胞模型中,与对照组相比,SW480和HT29细胞的迁移和侵袭能力均明显增强;体内实验结果表明,稳定下调Ran的HCT116细胞在裸鼠肺脏形成转移灶的能力明显低于对照组,镜下观察实验组肺脏转移灶的大小明显大于对照组。6.Western blot检测核浆蛋白结果显示:EGFR、β-catenin、NF-κB在细胞核中表达明显减少;而p53在细胞核中表达明显增多;在Ran的干扰细胞模型HCT116-sh Ran中,与对照组相比,p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK的表达均明显减少。在Ran的过表达细胞模型SW480-Ran和HT29-Ran中,与对照组相比,EGFR、p-EGFR、p-Akt、ERK、p-ERK的表达均明显增多。实时定量荧光PCR结果显示:在Ran的过表达细胞模型中,与对照组相比,SW480-Ran的EGFR m RNA水平上调到原来的1.8倍,HT29-Ran的EGFR m RNA水平上调到原来的1.9倍。免疫荧光结果显示:在DLD-1细胞中利用si RNA下调Ran的表达后,Ran的荧光强度下调72%,p-EGFR荧光强度下调35%。【结论】1.Ran在结直肠癌癌旁组织、原发灶及转移灶中的表达依次增高,且Ran在结直肠癌细胞系中高表达。2.Ran可以促进结直肠癌细胞增殖,并且抑制caspase-3介导的凋亡作用。3.Ran可以促进结直肠癌细胞发生转移。4.Ran可能通过调控EGFR的表达并影响Ras/MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路促进肿瘤的恶性表型的发生。