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分娩后,牛子宫基质细胞常因上皮细胞破裂而暴露于复杂的细菌和病毒刺激下,导致炎症反应从而影响牛的繁殖和生产性能。为研究子宫内膜炎的发病机制,我们使用体外模型研究了牛子宫内膜基质细胞（bovine endometrial stromal cells,b ESCs）对炎性介质脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的反应,同时采用高通量测序技术,对正常细胞和LPS刺激细胞的microRNA（miRNA）进行检测,筛选出表达差异大的miRNA进行生物信息学分析,探究其参与炎性反应的分子机制。综合分析结果,筛选表达量差异较大的bta-miR-1247-3p和bta-miR-200c进行下一步研究,通过双萤光素酶报告试验,验证bta-miR-1247-3p、bta-miR-200c与靶基因MAPK11、ZEB1的靶向关系,在b ESCs中过表达miRNA,检测相关分子表达量的变化,探究bta-miR-1247-3p、bta-miR-200c参与调控牛子宫内膜基质细胞炎性反应过程。本文从miRNA角度,为牛子宫内膜炎发病机理提供新的理论依据。本文研究内容包括:（1）牛子宫内膜基质细胞的分离培养与体外炎症模型的建立采用组织块培养法分离培养牛子宫内膜基质细胞,用胰酶差时消化法对基质细胞分离纯化,用免疫荧光法鉴定基质细胞特异性波形蛋白。结果显示,第2天组织块贴壁且有细胞从组织块中爬出,第6天细胞单层铺开,传代至第3代后可将上皮细胞和其他细胞除去得到纯度较高的基质细胞。显微镜下观察细胞形态呈梭形,免疫荧光结果显示波形蛋白表达呈阳性。选择P3-P8代纯度高,活力好的细胞用0.5μg/ml LPS刺激12 h,用RT-q PCR方法检测炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8）的表达,结果显示LPS处理组中炎症因子的表达量显著高于对照组,表明成功构建出体外炎症模型,为下一步高通量测序奠定基础。（2）LPS刺激对牛子宫内膜基质细胞miRNA表达变化的分析使用高通量测序来识别在脂多糖诱导的炎性反应中可能具有抗炎作用的miRNAs,将b ESCs分为空白组和LPS处理组。与对照组相比,LPS处理组有219个差异表达miRNAs,其中113个上调,106个下调。GO富集分析显示,差异表达miRNAs的靶基因在转移酶活性、小分子结合和蛋白结合等多种活性上均显著富集。KEGG通路分析表明,差异miRNAs的靶基因在流体剪切应力和动脉粥样硬化、MAPK信号通路、TNF信号通路中显著富集。通过分析差异表达的miRNAs,发现bta-miR-200c靶基因（ZEB1、ZEB2）和bta-miR-1247-3p靶基因（MAPK11、MAPK4、MAPK8、MAPK14）主要富集在Transcriptional misregulation in cancer和MAPK通路,这为进一步验证miRNA参与炎性反应提供思路。（3）bta-miR-1247-3p和bta-miR-200c靶基因及其参与分子通路的筛选和验证利用生物信息学软件程序Target Scan 7.2,筛选出bta-miR-1247-3p和bta-miR-200c的靶基因MAPK11和ZEB1,根据NCBI网站中公布的牛MAPK11和ZEB1 3?-UTR序列信息为模板,扩增出含有bta-miR-1247-3p和bta-miR-200c相应结合位点的片段,再用缺失引物扩增出不含其结合位点的片段,将片段插入到双萤光报告质粒psi CHECK-2中,构建野生型和缺失型载体,将质粒和miRNA mimics共转染b ESCs,24 h后检测荧光强度。双萤光结果显示,bta-miR-1247-3p和bta-miR-200c能够显著降低含有其相应结合位点的萤光素酶活性,RT-q PCR和Western blot结果显示过表达bta-miR-1247-3p能够降低MAPK11和ATF-2表达,对炎症因子TNF-α的表达也有抑制作用。此外,过表达bta-miR-200c能够降低ZEB1促进caspase3和cleaved caspase-3表达。提示过表达bta-miR-1247-3p能够降低细胞的炎性反应,过表达bta-miR-200c能够促进细胞凋亡蛋白的表达。综上,通过高通量测序,发现LPS刺激子宫内膜基质细胞后miRNA表达谱发生变化,其中bta-miR-1247-3p可通过靶向MAPK11参与调节细胞炎性反应、bta-miR-200c可通过靶向ZEB1调节细胞凋亡蛋白表达。