背景：银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,在全世界范围内累及人数大于125,000,000人,其发病机制复杂,包括角质形成细胞的增生和异常分化,显著的炎症浸润等。其中表皮角质形成细胞的过度增生由一系列细胞因子及信号通路激活,这些刺激因素又来源于免疫细胞以及角质形成细胞本身。Hedgehog (Hh)信号通路不仅在胚胎发育以及成人的内稳态维持中发挥重要作用,其异常活化也导致了一系列疾病的产生,包括基底细胞癌、胰腺癌、成视网膜细胞瘤以及髓母细胞瘤等。在生理性Hh信号通路传导过程中,Hh配体结合细胞表面受体Patched1(PTCH1),从而解除对Smoothened (SMO)的抑制作用。SMO的活化导致一系列细胞内事件的发生,通过转录因子GLI家族(GLI1、GLI2、GLI3)导致靶向基因表达的变化。在缺少Hh配体时,PTCH1抑制SMO的活动,从而使得转录因子GLI在纤毛内降解为抑制体的形式。其降解过程需要suppressor of fused (Sufu)和kinesin family member7(Kif7)的参与。哺乳动物的Hh配体包括三种,分别为Sonic hedgehog (Shh)、Indian hedgehog (Ihh)和Desert hedgehog (Dhh),其中Shh是皮肤中主要的Hh配体。以往的研究发现Hh信号通路在银屑病皮损区是被激活的,使用Hh通路的抑制剂环巴胺后能导致皮损的快速消退。但是,又有研究表明在银屑病皮损区中并没有Hh转录因子mRNA水平上的升高。因此,Hh信号通路是否在银屑病中过度激活以及其在银屑病发病机制中的作用仍需要进一步的研究。目的：明确Hh信号通路中的各个分子在银屑病皮肤组织皮损区角质形成细胞中的表达情况,并在体外培养的原代人表皮角质形成细胞中使用重组人细胞因子Sonic Hedgehog激活以及SMO的抑制剂环巴胺抑制Hh信号通路后观察细胞的增殖、凋亡、细胞周期变化、衰老、活性氧族的产生、迁移以及分化等功能变化；以及环巴胺在体外对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的作用。方法：第一部分：切取正常人以及银屑病病人皮损区皮肤,并分离出表皮,分离、培养正常人表皮角质形成细胞,提取总RNA和蛋白质。以逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR)检测正常人以及银屑病病人皮损区皮肤组织全皮、表皮以及表皮角质形成细胞Hh信号通路中各个分子的mRNA表达水平；以Western-blot法检测正常人以及银屑病病人皮损区表皮角质形成细胞Hh信号通路中各个分子的蛋白表达水平；以间接免疫荧光法对Hh信号通路中各个分子在正常人以及银屑病病人表皮中的表达进行定位；用酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测正常人以及银屑病病人外周血血清中Hh通路的三种配体Shh、Ihh以及Dhh的浓度水平。第二部分：使用外源性Sonic Hedgehog细胞因子以及Hh通路的抑制剂环巴胺处理体外培养的人表皮角质形成细胞,观察细胞增殖、凋亡、细胞周期变化、衰老、活性氧族的产生、迁移以及分化等功能变化。另外使用慢病毒感染人角质形成细胞使其过表达Hh通路的抑制因子Sufu后观察Hh通路GLI转录因子在nRNA、蛋白水平以及亚细胞定位中的变化,并进一步观察与角质形成细胞分化相关的蛋白表达水平变化。第三部分：体外用咪喹莫特诱导C57BL/6小鼠形成银屑病模型,并用不同浓度的环巴胺腹腔注射小鼠,通过PASI评分以及H&E染色观察其对银屑病皮损形成的抑制作用。结果：一、银屑病中Hh通路在mRNA水平上的激活：1.银屑病病人皮损区表皮中GLl3的mRNA表达与正常人相比显著降低；2.银屑病病人皮损区全皮中Sufu的nRNA表达与正常人相比显著降低；3.体外培养的银屑病病人皮损区表皮角质形成细胞中GLl3的mRNA表达与正常相比显著降低,而Shh、GLI1、Sufu的mRNA表达无显著差异。二、银屑病中Hh通路在蛋白水平上的激活：1.银屑病病人外周血血清中Shh、Ihh和Dhh浓度与正常人相比显著升高；2.体外培养的银屑病病人皮损区角质形成细胞中GLI3、SUFU、PTCH1和PTCH2蛋白表达与正常相比显著降低,GLl2略有升高,但差异不显著,Shh和GLl1无显著差异；3.免疫荧光检测结果发现,银屑病病人皮损区以及正常人表皮各层均有GLI1、GLI2和GLl3的表达,其中GLl3在银屑病皮损区表皮和正常人中的分布明显不同,在银屑病表皮中GLl3主要位于胞浆中,而正常表皮中GLl3主要位于胞核内。体外培养的银屑病病人皮损区角质形成细胞中GLl3主要位于胞浆中,而在正常人角质形成细胞中GLl3主要位于胞核内。三、重组人Shh刺激体外培养人表皮角质形成细胞引起的功能变化：1.重组人Shh剂量依赖性地促进角质形成细胞中GLl1的mRNA转录,但对Sufu及GLl3的mRNA转录无明显作用；2.重组人Shh剂量依赖性地促进角质形成细胞的增殖；3.重组人Shh促进角质形成细胞中活性氧族的产生。四、环巴胺作用于体外培养人表皮角质形成细胞引起的功能变化：1.环巴胺剂量依赖性地抑制角质形成细胞的增殖；2.环巴胺剂量依赖性地促进角质形成细胞的凋亡,而重组人Shh显著抑制角质形成细胞的凋亡；3.环巴胺导致角质形成细胞G1期的阻滞,而TNF-α能逆转环巴胺的G1期阻滞作用；4.体外培养的银屑病病人皮损区角质形成细胞衰老程度显著低于正常人；环巴胺能显著促进细胞衰老,丙酸氯贝他索能显著减少细胞衰老；TNF-α对细胞衰老无明显作用,而环巴胺能显著逆转丙酸氯贝他索导致的抗衰老作用；5.环巴胺能显著降低角质形成细胞的活性氧族产生,丙酸氯贝他索亦能显著降低细胞活性氧族产生；TNF-a能显著增加细胞活性氧族的产生,环巴胺能显著抑制TNF-a对活性氧族的促进作用；6.环巴胺能显著抑制角质形成细胞的迁移,Shh能显著促进细胞迁移,丙酸氯倍他索能显著抑制细胞迁移,TNF-a对细胞迁移无明显作用。五、体外培养人表皮角质形成细胞Sufu过表达引起的功能变化：1.人表皮角质形成细胞中mRNA及蛋白水平均验证了Sufu过表达的效率；2.人表皮角质形成细胞中Sufu过表达后GLI1和GLI2的蛋白表达均降低了；3.银屑病病人皮损区表皮角质形成细胞中Sufu过表达后与分化相关的蛋白表达升高了；4.银屑病病人皮损区表皮角质形成细胞中Sufu过表达后GLI3由胞浆转移至胞核内。六、环巴胺减轻了小鼠模型中银屑病皮损的形成：1.环巴胺降低了小鼠模型中银屑病皮损的PASI评分；2.H&E染色表明环巴胺减轻了咪喹莫特诱导的小鼠银屑病皮损的严重程度。结论：一、银屑病中Hh通路在mRNA及蛋白水平上均被激活了；二、Shh能促进角质形成细胞的增殖,抑制角质形成细胞凋亡,显著增加角质形成细胞活性氧族的产生,促进细胞迁移,从而证明Hh通路的激活在银屑病的发病中的作用；三、环巴胺能抑制角质形成细胞的增殖,可能与其促进细胞凋亡及阻滞细胞周期相关；环巴胺能促进细胞衰老,抑制活性氧族的产生并抑制细胞迁移能力；从而证明了阻断Hh通路对抑制银屑病发病的分子机制；四、Sufu过表达能抑制角质形成细胞中Hh通路的激活,进而促进银屑病表皮角质形成细胞的分化；五、环巴胺能抑制咪喹莫特诱导的小鼠模型中银屑病皮损的形成,从而为应用Hh通路抑制剂临床治疗银屑病提供了可能。