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microRNAs (miRNAs)在调控哺乳动物黑色素生成和毛色方面具有重要的作用,在不同毛色羊驼皮肤miRNA的表达谱分析中,发现一个新的miRNA(命名为lpa-miR-nov-66),并呈差异表达。经预测,soluble guanylate cyclase (sGC)是lpa-miR-nov-66的靶基因之一。本实验为了研究lpa-miR-nov-66与羊驼黑色素细胞产生黑色素之间的相关性,通过构建lpa-miR-nov-66表达载体,用双荧光报告载体验证了lpa-miR-nov-66的靶基因(sGC)；将lpa-miR-nov-66转染羊驼黑色素细胞,应用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELASA等方法对转染后黑色素细胞内相关基因和蛋白的表达水平进行检测,主要实验结果如下：1实时荧光定量PCR技术检测sGC, MITF, TYR, TYRP1基因mRNA表达水平。结果显示：sGC基因在lpa-miR-nov-66转染组中的mRNA表达水平是对照组的5.83倍,MITFmRNA在转染组和对照组中的差异不显著,TYR在转染组中的mRNA表达水平是对照组的0.75倍,TYRP1在转染组中的mRNA表达水平是对照组的0.53倍(P<0.05)。2Western blotting检测sGC,MITF,TYR,TYRP1蛋白表达水平。结果显示：与对照组相比,lpa-miR-nov-66转染组sGC,MITF,TYR和TYRP1蛋白表达量分别是对照组的3.15倍,0.50倍,0.187倍,0.621倍(P<0.05)。3酶标仪测定羊驼黑色素细胞黑色素含量。结果显示：与对照组相比,lpa-miR-nov-66转染组的黑色素含量为对照组的0.70倍(P<0.05)4ELISA法测定转染后羊驼黑色素细胞中cAMP和cGMP含量变化。结果显示：与对照组相比,lpa-miR-nov-66转染组的cAMP含量为对照组的0.57倍,cGMP含量为对照组的2.05倍(P<0.05)5双荧光报告载体(含sGC)和lpa-miR-nov-66表达载体共转染293T细胞,发现与对照组相比,报告基因的活性为对照组的0.69倍。上述结果揭示了lpa-miR-nov-66通过与靶基因sGC结合,通过参与cAMP路径,从而调控黑色素细胞内黑色素的合成,为研究lpa-miR-nov-66调控哺乳动物毛色形成的分子机制提供了有力的依据。