溶酶体(lysosome)是一种重要的细胞器,存在于所有原生动物和多细胞动物的细胞中,可以隔离通过内吞作用和自噬途径获得的大分子,进行降解和再循环。大规模的大分子更新对于哺乳动物卵母细胞的生长和发育至关重要。然而,溶酶体在哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟中的功能作用仍然不清楚。本研究通过特异性溶酶体抑制剂氯喹(CQ)处理体外成熟培养的猪卵丘-卵母细胞复合物(COC),研究了溶酶体在猪卵母细胞体外成熟过程中的作用和可能的机制,为相关研究提供新的参考。本研究主要实验结果如下:(1)利用荧光染色检测溶酶体显示溶酶体存在于卵母细胞成熟过程的每个阶段并且主要分布在卵质的皮质及外周细胞质区域,定量分析显示溶酶体的相对荧光强度从GV到GVBD保持稳定,然后从GVBD到MII显著降低(1.12 vs.0.83,P<0.001),表明溶酶体在猪卵母细胞成熟过程中存在并随着卵母细胞成熟进程动态变化。(2)向COCs成熟培养液中添加不同浓度的溶酶体特异性抑制剂CQ(0、25、35、45μM)不会改变卵母细胞的第一极体排出率,但会使MII期卵母细胞核染色体异常状态率显著增加(6.2%of control vs.34.7%,39.9%,71.2%,P<0.05),这些结果表明CQ处理抑制溶酶体以剂量依赖性方式诱导猪卵母细胞核异常。(3)利用荧光染色检测卵母细胞的纺锤体组装、氧化应激水平及早期凋亡情况发现,与对照组相比,35μM CQ处理诱导卵母细胞微管形态异常(34.7%of control vs.57.9%,P<0.01),破坏细胞膜上微丝的正常分布(1.0 of control vs.0.6,P<0.001),但不影响胞质内的微丝分布及p-ERK1/2水平。同时,抑制溶酶体显著提高卵母细胞早期凋亡率(9.1%of control vs.19.2%,P<0.01),降低抗凋亡基因Bcl2水平(1.00 vs.0.16,P<0.01),但是卵母细胞ROS水平没有显著变化。综上,抑制溶酶体造成卵母细胞骨架组装异常,早期凋亡率增加。(4)对CQ处理抑制溶酶体的成熟卵母细胞进行孤雌激活或体外受精后体外培养7天,结果表明,对于孤雌胚胎,CQ处理组死亡率显著升高(Control vs.35μM vs.45μM:2.75%vs.24.50%vs.50.59%,P<0.01),卵裂率显著降低(Control vs.35μM vs.45μM:89.90%vs.76.60%vs.75.51%,P<0.05),囊胚率显著降低(Control vs.35μM vs.45μM:61.05%vs.33.70%vs.33.92%,P<0.001),囊胚细胞数显著降低(Control vs.35μM vs.45μM:35.7 vs.25.0 vs.21.2,P<0.01);对于体外受精胚胎,卵裂率显著降低(Control vs.35μM vs.45μM:62.31%vs.44.21%vs.32.74%,P<0.05),胚胎碎裂率显著升高(Control vs.35μM vs.45μM:4.64%vs.16.49%vs.23.83%,P<0.05),囊胚率显著下降(Control vs.25μM vs.35μM vs.45μM:23.52%vs.16.41%vs.11.93%vs.5.54%,P<0.05),且每个囊胚的平均细胞数显著减少(Control vs.35μM vs.45μM:34.8 vs.21.3 vs.16.5,P<0.001)。综上,抑制卵母细胞中溶酶体功能可能通过诱导胚胎死亡或碎裂而影响它们在孤雌激活或体外受精后的发育能力。(5)检测自噬相关的m RNA和蛋白质水平发现,添加35μΜCQ处理的卵母细胞中LC3蛋白水平显著升高(0.6 of control vs.5.8,P<0.001),溶酶体膜标志物Lamp1、2的m RNA水平显著降低(1.00 vs.0.46,P<0.05;1.00 vs.0.14,P<0.001)。综上,在体外成熟过程中抑制溶酶体会影响卵母细胞自噬功能。综上所述,溶酶体在猪卵母细胞体外成熟过程中持续存在且呈动态变化,对卵母细胞减数分裂成熟具有重要作用,主要是通过调控细胞骨架组装及参与自噬途径来影响卵母细胞核成熟进程和后续胚胎发育能力。