【摘 要】
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MiR-125家族在胚胎发育过程中具有重要的调节作用。然而,mi R-125b-2在精子发生中的作用尚不清楚。因此,本研究通过CRISPR/Cas9技术构建mi R-125b-2敲除（KO）小鼠模型,通过野生型（WT）和KO小鼠的繁殖试验、高通量测序技术、q-PCR、双荧光素酶报告基因载体、Western Blot技术、苏木精-伊红染色法和si RNA沉默m RNA表达等技术研究mi R-125b
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MiR-125家族在胚胎发育过程中具有重要的调节作用。然而,mi R-125b-2在精子发生中的作用尚不清楚。因此,本研究通过CRISPR/Cas9技术构建mi R-125b-2敲除（KO）小鼠模型,通过野生型（WT）和KO小鼠的繁殖试验、高通量测序技术、q-PCR、双荧光素酶报告基因载体、Western Blot技术、苏木精-伊红染色法和si RNA沉默m RNA表达等技术研究mi R-125b-2敲除对公鼠生殖力的影响机制,研究结果如下:1.繁殖试验显示,与WT小鼠相比,母鼠敲除mi R-125b-2会显著减少产仔数（P<0.01）,公鼠敲除mi R-125b-2会显著升高不孕率,同时,公鼠的雌二醇浓度显著降低（P<0.05）,睾酮浓度显著升高（P<0.01）,精子数量明显减少（P<0.01）,精子异常比例显著增加（P<0.01）。2.小鼠精子线粒体DNA（mt DNA）拷贝数结果显示:与WT小鼠相比,KO小鼠mt DNA拷贝数显著增加（P<0.05）,但mt DNA完整性未发生改变。3.睾丸高通量测序结果显示:与WT小鼠相比,KO小鼠转录组文库中差异表达基因（DEGs）有324个（上调基因173个,其中包括睾丸特异性表达基因Papolb（PAP）,下调基因151个）。随机挑选了显著上调基因PAP、Kif2b、Gtsf11、1700013D24Rik和显著下调基因Yod1、Hils1、GK2、mt-Cytb、Oser1通过q-PCR验证了测序的准确性。KEGG和GO分析表明,DEGs中有许多基因参与精子线粒体代谢和其他细胞生物学过程。生物信息学分析,mi R-125b-2与PAP存在靶向关系。4.双荧光素酶、Si-PAP干扰试验结果显示:PAP和mi R-125b-5p（mi R-125b-2的一种）存在直接的靶向关系,mi R-125b-5p mimics/inhibitor通过靶向PAP调节间质细胞对睾酮的分泌（P<0.05）。5.检测睾丸原代细胞（生殖细胞（GC）、间质细胞（LC）和支持细胞（SC））中mi R-125b-2和PAP的表达量显示:mi R-125b和PAP都在GC中高表达,在LC和SC中表达量很低。综上所述,我们成功的构建了mi R-125b-2敲除小鼠模型,首次证明了mi R-125b-2通过直接靶向PAP调控睾酮分泌,使精子mt DNA拷贝数增加进而影响精子质量,同时mi R-125b-2可以通过调控PAP基因表达对雄性动物生殖性能有积极影响,更重要的是mi R-125b-2可能为治疗公猪不孕不育提供潜在药物和诊断靶点。
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