目的:1、研究江西某三甲医院替加环素非敏感肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征。2、通过基因组学探究替加环素非敏感肺炎克雷伯菌的耐药和毒力机制。3、探究高毒力替加环素非敏感肺炎克雷伯菌（25号菌株）基因组完成图及毒力特征。方法:1、收集2017年至2020年江西某三甲医院各种临床标本中分离的非重复的肺炎克雷伯菌5,729株,通过微量肉汤稀释法,筛查到34株替加环素非敏感肺炎克雷伯菌株。通过查阅病历了解菌株的临床信息和标本类型的分布;通过PCR及测序研究其耐药基因、毒力基因等分子流行病学特征;采用PFGE及MLST分析菌株的亲缘关系。2、将34株替加环素非敏感肺炎克雷伯菌应用第二代测序技术,从基因组水平进一步了解其生物学特征,包括毒力基因、耐药机制、质粒分型及菌株间进化关系等,并从基因组学角度分析替加环素非敏感肺炎克雷伯菌的可能的耐药机制。3、对第一、二部分中筛选出来的一株高毒力替加环素非敏感肺炎克雷伯菌—25号菌株,应用第三代测序技术绘制出基因组完成图,分析其毒力质粒和耐药质粒基因组特征。并将该菌株的毒力大质粒与4个已知的经典毒力质粒比较基因组。最后,结合生物被膜试验、血清抗性试验、侵袭大蜡螟试验和小鼠杀伤试验验证25号菌株的毒力。结果:1、筛选得到的34株TNSKP对所有抗菌药物都表现得低敏感性,除厄他培南、亚胺培南、美罗培南和阿米卡星耐药率低于90%,其他均高于90%甚至达到100%。流行病学分析结果显示,多数菌株（55.9%）来源于重症监护病区。患者平均年龄大（57.19±21.65岁）,住院时间长（42.5±30.1天）,且多数是置管状态（76.5%）。34株菌株的分子流行病学结果提示,PFGE可分为6种基因型,A型28株（82.4%）是主要簇群,且多数同时为ST11型;荚膜血清分型以K14.K64型为主。耐药基因检测发现30株碳青霉烯耐药的菌株均携有blaKPC-2基因,29株菌同时携带blaSHV-12、blaTEM-1、blaCTX-M-65和blaLAP-2β-内酰胺酶基因。替加环素耐药基因检测表明,除44号菌株其他菌株都检测到tet A和rps J基因,但均未发现有突变。毒力基因检测发现部分菌株携带有rmp A、rmp A2、uge、mrk D、kpn等毒力基因,其中所有菌株均能够检测出mrk D基因携带,所以有29株菌同时携带有mrk D、kpn和uge三种毒力基因（如1号、2号菌株等）,3株菌同时携带mrk D和kpn两种毒力基因（38、43和53号菌株）,只有一株25号菌同时携带有rmp A、rmp A2、uge、mrk D、和kpn五种毒力基因。2、应用第二代测序技术对所有TNSKP进行全基因组分析,发现所有菌株中都能够注释到多重耐药外排蛋白Acr B、Mdt K和Mdt G,且比较基因组分析中也发现所有菌株均携带acr A和acr B抗性基因。经毒力因子数据库比对后,发现本研究的TNSKP菌株的毒力因子主要与细菌的铁载体、黏附和生物被膜形成有关。此外,经plasmid finder注释,发现质粒复制子以Inc R+Inc FII+Col RNAI型为主（91.2%）,并发现一株携带与p Vir-CR-hv Kp4质粒相同毒力基因簇（iuc A+rmp A）的菌株（即25号菌株）。3、从前面两部分筛查出一株高毒力替加环素非敏感的肺炎克雷伯菌（TNS-hv Kp）,结合第二、三代测序技术得到了25号菌株的全基因组完成图。首先,通过数据库进行耐药基因和毒力基因注释发现25号菌株质粒（plasmid 3）上携有介导碳青霉烯类、β-内酰胺类、喹诺酮类和四环素类等耐药的耐药基因,plasmid 1携有iuc ABCD+iut A+rmp A的毒力基因簇。该毒力质粒与4个经典毒力质粒基因组比较发现具有一定的相似性。通过生物被膜形成试验、血清抗性试验、侵袭大蜡螟试验和小鼠杀伤试验,发现其毒力不亚于高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044。结论:1、该院的TNSKP碳青霉烯耐药以携带blakpc-2为主,荚膜血清分型以K14.K64型为主,ST11型为主要流行克隆株。2、应用二代测序技术从基因组水平分析发现多重耐药外排泵蛋白Acr B、Mdt K和Mdt G,及acr A和acr B抗性基因与替加环素非敏感密切相关。3、25号菌株是一株质粒上携带有毒力基因簇（iuc ABCD+iut A+rmp A）且有多个耐药基因的替加环素非敏感肺炎克雷伯菌,且证明其高毒力表型。