胚胎干(ES)细胞来源于早期胚胎囊胚的内细胞团,具有自我更新与多向分化潜能,在再生医学、发育生物学、功能基因组学等领域具有极大应用前景,成为了当前生命科学研究的重点和热点课题。ES细胞分化的抑制是其体外培养的首要课题。自1981年小鼠胚胎干细胞首次成功建立以来,研究者相继采用饲养细胞、含不同生长因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的条件培养基等抑制细胞的分化,但迄今仅少数物种如人、猪、牛、猴成功建立了ES细胞系。因此,ES细胞未分化状态维持及其分子机制在不同物种中的保守性如何,尚待进一步研究。鱼类ES细胞的研究主要局限于小型模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)和斑马鱼(Danio renio)。采用无饲养细胞的条件培养基(含鱼类胚胎提取物、自身血清)目前已成功建立了青鳉、斑马鱼ES细胞系,同时从一些海水鱼中也得到了类似ES细胞的培养物。从而表明,饲养细胞对于鱼类ES细胞系的建立并非必需。罗非鱼(在本研究中,如未特殊说明均指尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus))作为世界性养殖鱼类,具有生长快、抗逆性强、繁殖周期短(14天)等特点,是开展ES细胞研究及其应用研究的理想对象。LIF是IL-6(白细胞介素-6)家族重要成员,在造血干细胞、间充质干细胞、原始生殖细胞、神经干细胞的增殖、存活等方面均具有重要作用,特别是在ES细胞未分化状态维持方面的作用,备受关注。大量研究表明,LIF通过激活JAK/STAT3、PI3K/AKT信号通路维持小鼠ES细胞的未分化状态,但其未能维持人ES细胞的未分化状态。LIF在其他物种ES细胞中的作用如何,对于揭示ES细胞多能性调控机制的分子进化具有积极作用。鉴于此,本研究以罗非鱼为对象,开展了以下两方面研究:一是采用条件培养基分离、培养罗非鱼胚胎囊胚中期细胞,成功建立了胚胎干细胞系(命名为TES1),通过体外多能性分子检测、体外分化诱导、胚胎嵌合体的形成等对其体内外多能性及分化潜能进行了鉴定,通过细胞增殖能力的检测对其培养基中的不同成分进行了检测与优化;二是对罗非鱼Lif蛋白(OnLif)在TES1细胞的增殖、存活及未分化状态的维持中的作用进行了深入研究,主要研究结果如下:1.胚胎干细胞系的建立1.1细胞的分离、培养从罗非鱼中期囊胚分离细胞,用含Hepes、青-链霉素、胎牛血清(FBS)、非蛋白因子5N(包括谷氨酰胺、丙酮酸钠、亚硒酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇)、人成纤维细胞生长因子(bFGF)、罗非鱼胚胎提取物(TEE)及其血清(TS)的DMEM条件培养基在28℃培养,获得三个细胞系TES1-3,都表现出ES细胞样的特征。本文以TES1为主要研究对象,在无饲养层培养条件下稳定传代至59代200天,仍具有ES细胞样的克隆形成能力及典型的ES细胞样表型特征(细胞圆形或多角形、核大、核仁明显等)。1.2体外多能性碱性磷酸酶(AP)活性及多能性基因的表达是ES细胞检测的重要指标。在本研究中,AP活性检测发现,第55代TES1细胞均呈现强阳性;RT-PCR分析结果显示,第16代及第50代TES1细胞均明显表达pou5f3,sox2,myc和klf4等多能性基因,此外,通过荧光免疫组化实验,从蛋白水平检测到Pou5f3显著表达于TES1细胞。这些结果证明,TES1细胞具有体外的多能性。1.3体外分化潜能证明ES细胞具有体外分化能力的重要手段是诱导细胞分化形成内、中、外3个胚层,并最终得到拟胚体(EB)。本研究中,通过在培养基中加入诱导剂RA,TES1经过10天悬浮培养,形成类似于EB形态的细胞团。现有研究已证明nf200,actn2,hnf3b和sox10分别是内、中、外3个胚层及神经嵴特异的分化基因,RT-PCR分析证实,EB细胞团均表达这些分化基因。同时在诱导后贴壁的细胞中也观察到多种不同类型的分化细胞如星型细胞、神经元细胞和扁平细胞等。由此表明,TES1具有体外多向分化的潜能。1.4体内分化潜能将标记了PKH26(活细胞红色荧光染料)的TES1细胞移植进入受体罗非鱼中期囊胚,胚胎发育后期发现有35%的胚胎(n=501)是PKH26细胞嵌合体,有13%嵌合体胚胎发育成幼鱼,同时观察发现PKH26阳性细胞随着胚胎的发育分布在罗非鱼身体的不同部位,如躯干、眼和鳍,从而表明,TES1细胞在体内具有多向分化潜能。1.5染色体分析对第40代TES1细胞的染色体经分析发现,在统计的100个细胞中,超过70%都是二倍体核型(2n=44),同时其形态未见异常。从而表明,长期培养的TES1细胞具有遗传稳定性。1.6不同成分对TES1细胞增殖活性的影响为优化培养条件,TES1细胞正常传代培养至第28代时,通过CCK-8分别检测多种因子对其增殖的影响。结果显示,FBS浓度显著影响细胞增殖活性,在0-15%浓度范围内,FBS浓度越高,细胞增殖活性越强,超过15%时,随着FBS浓度增高细胞增殖活性越弱,表明TES1的增殖具有FBS浓度依赖;培养基中其他成分,包括胚胎提取物、鱼血清、5N均能促进细胞增殖,其中自身胚胎提取物及自身血清的促增殖活性显著高于其他鱼类来源的胚胎提取物及血清,从而表明,其促增殖活性既有物种保守性同时具有一定的物种特异性;不同浓度(5,10,20 ng/ml)bFGF均能促进细胞增殖,其中10ng/ml是其最适浓度。2.OnLif对TES1未分化状态的维持2.1细胞增殖用分别含有1、10、100 ng/ml OnLif的基础培养基处理TES1细胞24、48、72、96 h后,CCK-8检测结果显示,1、100 ng/ml OnLif对TES1的增殖无明显促进作用(p>0.05),而10 ng/ml OnLif从48 h开始能显著促进TES1的增殖(p<0.01);EdU掺入法检测进一步证实了上述结果,从而表明,OnLif能明显促进TES1的增殖并且具有浓度依赖性。2.2细胞存活在低、中、高细胞密度条件下,用基础培养基、含10 ng/ml OnLif基础培养基及完全培养基TESM处理TES1,结果发现,在低、高密度条件下,对照组大量细胞凋亡,特别是低密度条件下几乎无细胞存活,而含On Lif的实验组与TESM组细胞状态基本一致,细胞生长状态良好,未观察到明显细胞凋亡;在中密度条件下,对照组光镜下虽然未观察到明显的细胞凋亡,AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染实验结果发现,24 h对照组与实验组无显著差异,但是48 h对照组细胞凋亡率(22.8%)明显高于实验组(8.9%)(p<0.01)。从而表明,OnLif能抑制TES1细胞的凋亡,促进细胞存活。2.3多能性活性用含OnLif培养基培养TES1细胞3天和5天后,半定量RT-PCR和AP活性检测细胞多能性活性,结果显示,实验组细胞多能性标志基因pou5f3、sox2、myc、klf4的表达及AP活性明显高于对照组,分化标志基因nf200、actn2、hnf3b的表达低于对照组或不表达,此外,Pou5f3的免疫组化及其启动子载体pT2AL-Onpou5f3-GFP转染进一步证实实验组细胞多能性活性明显强于对照组。这些表明,OnLif可以促进TES1细胞的未分化状态的维持。本研究成功建立了罗非鱼胚胎干细胞系,并首次证实白血病抑制因子在维持鱼类胚胎干细胞未分化状态中的作用,将推进我们对LIF在鱼类ES细胞自我更新和维持中作用机制的进一步认识,对揭示ES细胞多能性调控机制的分子进化具有积极作用。