稻瘟病(Rice blast)是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染导致的,该病害是水稻上的三大主要病害之一。稻瘟病菌以典型的侵入方式侵染水稻,其分生孢子萌发生成芽管,芽管伸长尖端分化形成一个特殊的侵染结构-附着胞。正常成熟的附着胞利用甘油等物质作为溶质,围绕附着胞沉积黑色素,其最大能产生8 MPa的膨压,作为稻瘟病菌侵入寄主的机械压力,进而使侵染钉成功进入寄主植物表皮,再发展成次生菌丝,形成病斑。咪鲜胺是一种咪唑类杀菌剂,属于麦角甾醇生物合成抑制剂(SBIs),杀菌谱广。主要用于防治禾谷类作物白粉病和叶斑病,兼有治疗和保护作用。咪鲜胺在中国也用于防治稻瘟病,并有20多年用药历史。不仅在生产上未见稻瘟病菌对咪鲜胺产生抗药性的报道,而且尚缺少咪鲜胺抗性风险的系统研究。本论文以稻瘟病野生敏感菌株S-1为材料,在含有咪鲜胺亚致死剂量的PDA培养基平板培养诱导抗药性。接种3000个菌碟,在28℃黑暗条件下驯化培养20d。共获得30个对咪鲜胺的抗药性突变体,突变频率为1%。根据抗药性水平高低,我们将稻瘟病菌对咪鲜胺的抗性水平分为低抗、中抗和高抗三种类型。驯化培养获得的30个抗药性突变体均为低抗类型,并在没有选择压力下继代培养保持稳定的低抗水平。利用PCR技术扩增30个稻瘟病菌抗药性突变体及S-1菌株的CYP51A和CYP51B基因,测序比对发现所有咪鲜胺抗性突变体的CYP51A上均有1～2个改变氨基酸的碱基突变。根据氨基酸变化可将30个突变体分为三种类型.:7株为Ⅰ类型F496L、1株为Ⅱ类型L218R和F496L及22株为Ⅲ类型P271L和F496L。研究30个咪鲜胺抗性突变体的菌丝生长速率、无性繁殖能力以及在大麦叶片上的致病力等生物学表型,发现抗药性突变体较出发菌株S-1菌丝生长速率下降,对大麦叶片的致病力显著下降,甚至丧失致病性,无性繁殖能力下降;抗药性突变体对温度、PH值和渗透压的适应能力与其敏感菌株相比均有所下降。抗咪鲜胺突变体对氟环唑、戊唑醇、己唑醇和嘧菌酯无交互抗性。通过亲本敏感菌株S-1和抗药性菌株的CYP51A基因同源交换,结果发现置换有抗药性突变体CYP51A基因的转化子均对咪鲜胺表现出抗药性,置换有敏感菌株CYP51A基因的转化子对咪鲜胺表现出敏感性。这些结果表明CYP51A基因发生点突变是稻瘟病菌对咪鲜胺产生抗药性的遗传机制。同时,通过qRT-PCR分析证明驯化获得的30个稻瘟病菌抗药性突变体的抗药性与CYP51A和CYP51B基因转录水平无关。敏感菌株S-1的CYP51A蛋白与咪鲜胺分子的对接能与LYS137形成氢键,其分值为2.9158。而在抗性菌株RA、RB和RC中CYP51A蛋白与咪鲜胺分子的对接分别能与TYR126,LYS137和TYR112形成氢键,并且分值低于敏感菌株分别为2.3105、1.9991和1.9315,说明CYP51A蛋白的点突变降低或者阻止了咪鲜胺分子与CYP51A蛋白的结合。本研究表明,在咪鲜胺选择压力下稻瘟病菌CYP51A基因虽然可发生1%的低水平抗药性点突变,但是突变体的适合度显著下降,抗药性风险较低。该研究结果对于指导咪鲜胺的合理使用及抗性治理具有理论和应用价值。