反刍动物瘤胃内源和外源尿素氮的高效利用,不仅有助于节约日粮蛋白,增加微生物蛋白产量,还能减少氮排放。尿素的分解依赖于瘤胃微生物脲酶,脲酶活性过高是导致尿素氮利用率偏低的主要原因。为了调控脲酶活性,本研究运用宏蛋白质组学技术对瘤胃微生物脲酶进行鉴定,然后采用体外克隆、表达、纯化方法得到瘤胃微生物脲酶辅助蛋白UreE和UreG,揭示了UreG与UreE的结合特征以及影响脲酶活化的UreG关键残基,最后以UreG为靶标筛选天然化合物脲酶抑制剂来调控瘤胃微生物脲酶活性。主要研究结果如下:1.为了使宏蛋白质组学技术更好的应用在瘤胃微生物脲酶鉴定方面,对宏蛋白质组学流程中的蛋白提取和蛋白消化步骤进行优化,结果表明,6种活性蛋白提取方法（超声破碎提取、常温研磨提取、液氮冷冻研磨提取、高压破碎提取、反复冻融提取和试剂盒抽提）中,液氮冷冻研磨4分钟可以提取到最高脲酶活性的蛋白;4种蛋白消化方式（溶液内胰酶酶解、胶内胰酶酶解、溶液内Glu-C/Lys-C联合酶解和胶内Glu-C/Lys-C联合酶解）中,胶内胰酶酶解可以鉴定到最多数量高质量的蛋白。2.为了提高蛋白鉴定的准确性,提取样本本身DNA,分别进行宏基因组测序和脲酶基因扩增测序,将测序结果处理后构建样本本身蛋白质数据库。为了提高样品中活性脲酶的纯度,对液氮冷冻研磨提取的蛋白进行凝胶过滤层析纯化,得到最高脲酶活性的馏分。然后采用胶内胰酶酶解的方法进行蛋白质消化,以样品本身蛋白质数据库进行数据搜索,结果表明,瘤胃微生物活性脲酶与来源于Fibrobacter sp.和Treponema sp.的脲酶的同源性高。3.脲酶主要由结构蛋白和辅助蛋白组成,其中辅助蛋白UreE和UreG在脲酶活化过程中具有重要作用。运用微等温滴定量热仪和分析超速离心技术发现,瘤胃微生物脲酶UreE和UreG结合形成UreE2-2UreG复合体,此蛋白结合过程是一个以疏水作用为主的吸热过程。结合定点突变技术发现,UreG残基Glu66、Cys70、His72、Asp78在UreE和UreG的结合以及镍离子的传递过程中发挥重要作用。4.鉴于UreG在脲酶活化过程中重要的桥梁作用,以及本身的保守性,以UreG为靶标筛选脲酶抑制剂是调控脲酶活性的新途径。通过检测天然化合物对UreG的GTPase活性的影响,筛选了盐酸小檗碱、表小檗碱和盐酸白屈菜赤碱3种有潜力的脲酶抑制剂。进一步评估这3种化合物抑制UreG的作用机制,发现表小檗碱作用于UreG的CPH金属结合基序附近,显著降低UreG与镍离子的结合,且对瘤胃粗酶液和刀豆脲酶的抑制作用显著强于乙酰氧肟酸,是一种很有潜力的天然化合物脲酶抑制剂。