论文部分内容阅读
目的： 研究在胃癌细胞中利用慢病毒载体系统过表达miR-124，观察其对胃癌细胞生长、侵袭的影响；并探究其机制，为miR-124在胃癌临床治疗中的潜在应用提供实验基础。 方法： ⑴qRT-PCR检测胃癌组织及其相应的癌旁正常组织中miR-124的表达水平；MSP检测了胃癌组织及其相应的癌旁正常组织中miR-124 DNA的三个CPG位点甲基化水平。⑵构建过表达人 miR-124基因的慢病毒表达载体（Lenti-miR-124），与慢病毒包装质粒（pCMV-VSVG、pMDLg/pRRE和pRSV-REV）共转染HEK293T细胞，包装慢病毒，然后分别将病毒转染胃癌细胞，建立稳定表达 miR-124的胃癌细胞株。⑶CCK-8试验检测过表达miR-124对胃癌细胞SGC-7901和AGS增殖的影响；Transwell试验检测过表达miR-124对SGC-7901和AGS细胞迁移和侵袭的影响。⑷向裸鼠皮下植入转染过 Lenti-miR-124（稳定过表达 miR-124的慢病毒载体）或Lenti-GFP（对照慢病毒载体）的SGC-7901细胞，构建裸鼠荷瘤模型；随后观察两组裸鼠成瘤情况，记录瘤块体积。⑸Western Blotting检测过表达miR-124对胃癌细胞SGC-7901及AGS中JAG1及EZH2蛋白水平的影响，qRT-PCR检测临床人胃癌及癌旁样本中JAG1及EZH2mRNA表达水平。⑹合成特异靶向JAG1基因的siRNA，转染SGC-7901细胞；CCK-8及Transwell试验分别检测siRNA干扰JAG1表达后对SGC-7901细胞生长及迁移侵袭能力的影响。⑺慢病毒载体Lenti-shEZH2（前期构建）转染SGC-7901细胞；CCK-8及Transwell试验分别检测干扰EZH2表达后对SGC-7901细胞生长及迁移侵袭能力的影响。8、分别在过表达miR-124、敲除JAG1或EZH2的SGC-7901细胞中，采用Western Blotting检测Fibronectin和Vimentin蛋白表达的变化。 结果： ①与癌旁组织相比，胃癌组织中miR-124表达显著降低；miR-124基因三个CPG位点（miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3）的甲基化水平在胃癌组织中显著高于癌旁正常胃组织。②CCK-8试验显示过表达miR-124抑制SGC-7901和AGS细胞的增殖；Transwell结果显示过表达miR-124显著抑制SGC-7901和AGS细胞的迁移和侵袭能力。③慢病毒载体系统介导的miR-124过表达抑制了胃癌细胞裸鼠异位移植瘤的生长。④qRT-PCR结果显示在胃癌新鲜组织中，JAG1及EZH2mRNA水平较相邻正常胃组织显著升高。⑤Western Blotting结果显示在胃癌细胞中过表达miR-124抑制JAG1和EZH2的蛋白表达。⑥CCK-8及Transwell结果显示siRNA干扰JAG1或shEZH2干扰EZH2表达后均可抑制SGC-7901细胞生长并减弱其迁移侵袭能力。⑦Western Blotting结果显示在过表达miR-124、敲除JAG1或EZH2的SGC-7901细胞中，Fibronectin和Vimentin蛋白表达量下降。 结论： miR-124基因在胃癌组织中存在广泛的甲基化且表达下调。慢病毒载体介导的miR-124过表达可抑制胃癌细胞生长，迁移和侵袭，并抑制胃癌细胞在裸鼠体内的致瘤能力。JAG1和EZH2在胃癌细胞中表达上调，过表达miR-124可抑制JAG1和EZH2在胃癌细胞中的表达。沉默JAG1或EZH2可抑制胃癌细胞增长、迁移和侵袭，并下调Fibronectin和Vimentin的表达水平。