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胰岛移植或β细胞替代足糖尿病最理想的治疗手段,但细胞来源严重匮乏及免疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞(human embryonicstem cell,hESCs)诱导为胰岛素分泌细胞,成为β细胞替代物的新资源,为解决细胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由ESCs获得胰岛素分泌细胞,但均存在各种限制,目前仍缺乏将ESCs诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞的最佳方案。探索诱导人hSCs分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞,并制定出有效而高效的分化方案,成为本课题的主要研究目的。第一,本研究摸索了在体外培养、扩增、冻存、复苏hESCs细胞株(PKU1)的条件,并对其特异性标志物进行了检测。结果显示,hESCs经多次传代后仍然表达OCT-4和Nanog基因,免疫荧光法显示呈OCT-4、SSEA-4阳性,流式细胞术分析显示,OCT-4、SSEA-4阳性细胞比例分别达89.38%、83.44%;染色体核型分析表明为正常女性染色体核型(46,XX)。第二,采用酶消化法分离出胎龄14-18W的胎儿胰岛,经悬浮培养、双硫腙(DTZ)染色后种植到组织培养皿中,再以免疫荧光法检测一些细胞标志物的表达。结果显示,悬浮培养条件下,胎龄14-18W的胎儿胰岛细胞聚集成球形细胞簇,呈DTZ阳性,培养液中能检测到一定量的胰岛素和C-肽,贴壁培养后还能检测到胰岛细胞标志物insulin和glucagons及前体细胞标志物PDX-1、CK-19和Nestin的表达,证实14-17W胎儿胰岛已具备一定的胰岛特性和前体细胞的特征。第三,模拟胰腺发育分化的生理过程,研究设计出五阶段诱导方案,具体如下:(1).撤除分化抑制因素使hESCs形成拟胚体(EBs),悬浮培养48h;(2).将EBs转移至明胶包被的组织培养皿后,加入含Activin A和bFGF及LY294002的诱导培养基Ⅰ诱导5天,向定形内胚层诱导分化。RT-PCR法鉴定SOX17和FOXA2的基因表达,与同期自发分化的EBs进行比较,免疫荧光法检测SOX17的表达。(3).将细胞转移至laminin包被的培养皿,加入含bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清诱导培养基Ⅱ作用14d,向胰腺前体细胞诱导。RT-PCR法和免疫荧光化学法分别检测前体细胞标志物PDX-1及Ngn3表达。(4).添加含IGF-1、betacellulin、尼克酰胺、GLP-1、laminin的低血清诱导培养基Ⅲ作用14d,促进胰岛细胞分化,RT-PCR法检测细胞胰岛素基因的表达,免疫荧光化学法检测分化细胞胰岛素和C-肽的表达。(5).将细胞转移至低黏附性培养皿中,撤除IGF-I继续培养3天,促进细胞成熟。应用双硫腙(DTZ)染色液对获得的细胞团进行染色,应用RT-PCR法检测了胰岛素和胰高血糖素基因表达,应用RIA法分别测定了获得的细胞团培养液上清和胞浆中的胰岛素、C-肽含量,并与胎儿胰岛培液上清进行比较,静态培养胰岛素释放试验测定胰岛素与C-肽分泌是否呈葡萄糖反应性。结果(1).hESCs悬浮培养2d后,形成类球形EBs;(2).经第二阶段诱导后,细胞表达SOX17和FOXA2基因,且表达量高于同期自发分化的EBs,基本不表达外胚层标志物SOX1,随诱导时间延长,FOXA2表达逐渐增强;免疫荧光化学法显示,诱导5天的细胞胞核呈SOX17。(3).经第三阶段的诱导,细胞呈上皮样集落,RT-PCR法检测到细胞表达PDX-1、Ngn3及微弱的Pax4基因,免疫荧光法显示细胞呈PDX-1阳性。(4)经第四阶段的诱导,集落中一部分细胞聚集成多层,RT-PCR显示,不同诱导时期均有胰岛素基因的表达,且随诱导时间延长表达水平逐渐升高;免疫荧光显示,部分细胞呈胰岛素和C-肽阳性。(5).经第五阶段诱导后,hESCs来源的细胞呈类似胎儿胰岛的胰岛样细胞簇(ICCs),呈DTZ阳性,RT-PCR检测到Insulin和Glucagon基因表达,RIA法检测到ICCs培液上清中含胰岛素与C-肽,水平与15-17W胎儿胰岛培液上清相近(P＞0.05),胞浆内的胰岛素和C-肽水平分别为1089.2±217.06μIU/ml和181.33±30.12ng/ml,静态培养胰岛素释放试验验证了ICCs分泌的胰岛素呈糖反应性。应用五阶段分化方案,hESCs能够有效的分化为具有部分β细胞特性和糖反应性胰岛素分泌功能的细胞,为DM细胞替代治疗提供了有潜力的细胞来源和良好的临床应用前景。