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目的:探讨免疫调控受体TIGIT在“怒”心理应激大鼠胸腺组织和外周血T细胞中的表达和作用意义,阐明该免疫调控受体在心理应激反应发生和发展过程中的作用,进一步为中医“怒伤肝”的致病机理提供新的研究契机及更多的理论依据。方法:选取清洁级(SPF)的8周龄Wistar雄性大鼠48只,随机分成无应激对照组(A)、“怒”模型7天组(B)、14天组(C)、21天组(D),每组12只。除SF组外,其余各组以“社会隔离法”和“足底电击法”进行“怒”模型大鼠复制。按以上时间节点进行如下研究。1.实验前后采用旷场试验、攻击行为试验观察“怒”大鼠行为学变化。2.HE染色观察大鼠胸腺结构和细胞形态、Tunel法观察胸腺细胞的凋亡现象,以明确大鼠接受“怒”应激后的免疫细胞凋亡情况。3.免疫组化法(SP法)和western blot(WB)从蛋白水平检测应激大鼠胸腺组织和外周血单个核细胞(PBMC)的TIGIT/CD155及PDCD5的变化。4.流式细胞术多色荧光分析大鼠外周血PBMC中CD3~+、CD4~+、CD8~+T细胞亚群分布比例并计算CD4/CD8比率以观察T细胞的分化选择。5.Elisa法测定外周血CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平,分别从激素水平判断大鼠的应激状态以及从免疫因子的分泌水平反映大鼠的免疫功能。6.以上实验数据统计方法组间比较采用单因素方差分析,应激前后的行为学得分比较采用配对t检验进行分析;胸腺及外周血PBMC的SP法结果Image Pro Plus 6.0软件统计阳性图像的平均光密度值(MD);用Graph Pad Prism6.0软件对MD值进行相关性分析。结果:1.行为学测试结果:旷场试验:实验前1天,“怒”模型各组大鼠的行为参数与对照组比较,差异均无显著性意义(P>0.05);实验后,“怒”模型21天组的水平得分(HM)、垂直得分(VM)、修饰次数(MT)得分均明显上升(P<0.01),模型7天组VM与模型14天组HM有所升高(P<0.05或P<0.01)。实验前后,对照组HM和VM呈逐步降低趋势(P<0.05或P<0.01);“怒”模型组呈先下降后上升趋势(P<0.05或P<0.01)。攻击行为试验:实验前1天,“怒”模型各组大鼠的行为参数与对照组比较,差异均不明显(P>0.05);实验后,“怒”模型各组大鼠攻击隐藏时间(HTA)均明显降低(P<0.01),攻击次数(NA)、攻击累积时间(CTA)均明显升高(P<0.01或P<0.05),试验总得分(TSA)差异无显著性意义。2.HE染色结果:400倍光镜下,对照组大鼠胸腺皮质部饱满,原始T淋巴细胞密集分布,胞核染色呈深蓝紫色,排列整齐、间隙疏松,胞质较少,见少量巨噬细胞呈淡红色。“怒”模型各组大鼠胸腺皮质部呈现不同程度的组织结构损坏,原始T细胞布排紊乱,数量较对照组减少,细胞间隙缩小,部分呈“条索”堆积,凋亡现象增多:细胞核染色变浅、部分出现核固缩、分裂或呈“片状”溶解。3.Tunel法检测结果:免疫荧光显示阳性(凋亡状态)的胸腺T细胞胞核呈绿色荧光,DAPI复染阴性为蓝色荧光;凋亡强度关系:对照组<模型21天组<模型14天组<模型7天组,且差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01);模型组间比较,7天组明显高于14天、21天组(P<0.01),14天组明显高于21天组(P<0.01)。4.SP法检测结果:胸腺:分别在胸腺皮质部幼稚T细胞胞膜(TIGIT)或胞核(PDCD5)周围包绕棕黄色反应带,TIGIT和PDCD5蛋白表达MD值强弱关系一致,顺序为:对照组<模型21天组<模型14天组<模型7天组,除模型21天组两种蛋白表达上升不明显,其余各组此两种蛋白差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。外周血:涂片细胞胞膜周围包绕棕褐深色反应带,TIGIT蛋白表达强弱关系与上述胸腺T细胞结果一致,以“怒”模型7天组的TIGIT表达活性最为明显(P<0.01)。5.Western-Blot法检测结果:胸腺组织中TIGIT蛋白含量水平关系为:对照组<模型14天组<模型21天组<模型7天组,模型各组蛋白含量均明显高于对照组(P<0.01);模型组间对比:以模型7天组显著高于模型14天、21天组(P<0.01),模型14天组明显低于模型21天组(P<0.01);胸腺CD155蛋白水平关系为:模型各组均明显高于对照组(P<0.01),模型组间对比差异不显著,无统计学意义。6.流式细胞术检测结果:CD3~+、CD4~+T细胞亚群表达水平关系:模型7天组<模型14天组<模型21天组<对照组。其中模型7天、14天组较对照组具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。而CD8~+T细胞亚群方面模型各组均有上升,以模型7天组最为显著(P<0.05)。此外,“怒”模型各组的CD4~+/CD8~+比值均降低,以模型7天组最为显著(P<0.01)。7.血清CRH、ATCH、IL-2、IL-10浓度测量结果:“怒”模型7天、14天组激素CRH、ACTH浓度较对照组明显上调(P<0.01),模型21天组变化不明显;“怒”模型各组IL-2表达水平均呈现下调趋势,以模型7天组最显著(P<0.01),反观IL-10表达水平均呈现上调趋势,以模型14天组最为突出(P<0.01)。8.相关性分析结果:胸腺中的TIGIT与PDCD5蛋白表达水平呈正相关(r=0.6784,P<0.0001);胸腺中的TIGIT蛋白表达水平与CD4~+/CD8~+比例呈负相关(r=-0.7918,P<0.0001);外周血单个核细胞中TIGIT蛋白表达水平与CD4~+/CD8~+比例呈负相关(r=-0.7902,P<0.0001)。结论:1.慢性“怒”应激过程中,大鼠行为学得分呈明显波动性变化;外周血CRH、ACTH激素呈周期性升高,其中以应激7天时分泌水平最高。2.慢性“怒”应激过程中,大鼠胸腺TIGIT和PDCD5蛋白呈一致周期性表达,其中以应激7天时活性最高;两者共同介导胸腺幼稚T细胞“衰竭”导致胸腺萎缩,以达到免疫抑制效应。3.慢性“怒”应激过程中,大鼠外周血单个核细胞TIGIT蛋白表达活性出现周期性上调,以应激7天时最高,导致外周效应T细胞亚群分布失衡以及免疫因子分泌紊乱,以达到免疫抑制效应。综上所述,“怒”应激反应对免疫系统的抑制性调控可以通过胸腺形态学改变以及免疫调控受体TIGIT所介导的TIGIT-CD155信号通路来实现,TIGIT可能作为神经-内分泌-免疫和细胞凋亡反应中重要的互联分子,在心理应激的病理过程中发挥着重要作用。