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研究背景：绵羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenomatosis, OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤疾病。JSRV属于p逆转录病毒属,基因组主要包含病毒的结构基因gag、pro、pol和env。其中env是一个癌基因,它的表达产物囊膜蛋白(Env)由表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)两个亚基组成,彼此间以二硫键相连。JSRV的受体为透明质酸酶2(Hyaluronoglucosaminidase2, Hyal-2)。由于NIH3T3细胞具有强烈的接触抑制特性,能根据失去接触抑制而明确地识别已发生转化的细胞,故作为一种重要的细胞用于JSRV致瘤机制的研究。近年的研究显示,单独表达JSRV Env对于诱导NIH3T3细胞转化是必须和充分的,但其具体的转化分子机制中仍存在一些值得探讨的地方。研究目的：进一步探究JSRV Env及其亚基(SU和TM)诱导NIH3T3细胞转化的分子机制,这对于深入阐明OPA的分子发病机制及确定相应的防控靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究方法：1.应用RT-PCR的方法从绵羊瘤胃组织总RNA中扩增Hyal-2的编码序列,构建含有绵羊Hyal-2基因编码区的真核表达质粒。将该真核表达质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选、纯化后,以制备稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系。2.采用JSRV Env及其亚基真核表达质粒分别诱导转化NIH3T3细胞和稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系,并检测比较各转染组与空白对照组间,细胞的接触抑制特性、非锚定依赖性生长能力、增殖活性以及磷酸化Akt含量的差异。3.设计小鼠源kras、nras、egfr、p53和pik3ca肿瘤相关基因常见突变所在外显子的突变点检测引物,采用PCR-SSCP和核酸测序分析法检测JSRV Env及其亚基诱导转化细胞中肿瘤相关基因的突变情况。4.以内蒙古地区OPA自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆JSRV前病毒的gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与已有的LTR、env基因连接起来,以获得含有JSRV前病毒全基因组的重组质粒。研究结果：1.成功构建了含有绵羊Hyal-2基因编码区的真核表达质粒pcDNA-Hyal2-HA,并建立了稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系。2.在NIH3T3细胞中,Env及TM具有诱导细胞转化、激活Akt的能力；而在稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系中,仅TM具有这样的能力。3.在JSRV Env及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的过程中,肿瘤相关基因kras、nras、egfr、p53和pik3ca均未发生突变。4.成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD-JSRV。核酸序列分析结果表明,本研究重组克隆的pMD-JSRV基因组全长7690bp,具外源性JSRV典型的分子特征,属JSRV-Ⅱ型,与分离自美国的代表株AF105220亲缘关系较近,同源性达95%。结论：1.本研究成功构建了稳定表达绵羊Hyal-2受体NIH3T3细胞系。2.在JSRV Env诱导NIH3T3细胞转化并激活Akt的过程中,其TM亚基起到了主要作用,并且TM亚基还具有单独诱导NIH3T3细胞转化的能力。3.绵羊Hyal-2具有抑制JSRV Env诱导NIH3T3细胞转化的作用。4.JSRV Env及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的分子机制与肿瘤相关基因突变可能无关。5.本研究成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD-JSRV。这为进一步研究JSRV其他结构蛋白对其Env诱导NIH3T3细胞转化的影响建立了实验平台。