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大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是一种世界性的病毒性病害,在各大豆产区均有发生,严重影响大豆的产量和商品价值。病毒的变异、重组是新病毒产生、寄主范围改变以及致病性变化的重要原因。了解病毒信息,明确病毒的致病性,对防控病毒的大面积流行有着重要的作用。重组型SMV是2011年Yang等从重庆大豆产区发现的一种新型SMV病毒类型,目前对于这种新型SMV类型的系统性研究还未开展,新型SMV的出现也使大豆病害防治和抗病育种工作面临新的挑战。本研究目的是在发现重组型SMV的基础上调查黄淮海地区SMV的组成情况,通过分离纯化获得重组型SMV分离物,并对其进行全基因组测序,分析其系统发育学分类和地位;选取一些国内外的大豆品种,利用重组型SMV进行抗性鉴定,分析其致病性和侵染力与非重组型SMV差异;构建感染重组型SMV的模式作物的酵母双杂文库,奠定深入研究重组型SMV侵染机制的物质平台。具体研究内容和结果如下: (1)从黄淮海地区共采集357份病样,利用DSA-ELISA和RT-PCR两种方法进行检测,结果显示162份病样呈SMV阳性,检出率为45.4%。其中,83份病样仅检测出非重组型SMV,7份病样仅检测出重组型SMV,其余72份病样均检测出两种类型SMV。此外,重组型SMV在河北省、安徽省及北京市的大豆产区均有分布。在162个SMV样品中,含非重组型SMV的病样占比95.6%,含重组型SMV的病样占比48.7%;结果表明黄淮海SMV病害仍以非重组型SMV为主,但重组型SMV也广泛分布,需要进一步关注。 (2)利用菜豆品种Top-Crop采用枯斑分离的方式获得了一个来源于河北省的重组型SMV分离物HB-RS。利用RT-PCR方法对其进行全基因组扩增和测序结果显示,HB-RS除poly-A尾巴外,由9993个核苷酸组成,翻译后形成3202个氨基酸,比非重组型SMV分离物Sc6多出135个氨基酸。系统进化树结果显示,除重组类型SMV外,HB-RS与Sc6亲缘关系最近。其中,HB-RS的5UTR与P1的2/3N端与BCMV同源性最高,其余均与SMV同源性最高。研究结果表明,HB-RS仍属于SMV一种,是由BCMV和SMV在P1编码区重组而来。 (3)选取15份以往抗性鉴定中表现较好的大豆品种,利用人工接种的方法鉴定对HB-RS抗性表现,结果显示对HB-RS表现免疫、中抗和感病的材料分别有5份,1份和8份。进一步选取其中4个抗感层次不同的品种进行接种Sc6后对比分析,并利用qRT-PCR方法对两种类型的SMV在大豆叶片中的浓度积累进行检测。结果显示,症状上Sc6侵染寄主后容易形成坏死斑,HB-RS则主要以轻花叶为主;但HB-RS在4个大豆品种中病毒积累浓度却显著高于Sc6,结果表明HB-RS对大豆更具有侵染性,但致病力较Sc6弱。 (4)以可系统侵染本氏烟的重组型SMV分离物HB-RS为毒源,构建感染HB-RS本氏烟的酵母双杂cDNA文库。利用SMART技术获得本氏烟的双链cDNA文库,通过双酶切手段将cDNA文库构建至pGADT7-SfiI载体上。检测结果显示,文库容量约为3.2×106 cfu,插入cDNA片段长度在0.75~2Kb之间,平均长度大于1kb,且多态性丰富,表明文库质量较好。 以上研究结果表明:重组型SMV在黄淮海地区分布普遍,在北京、安徽、河北各省市均有发现。且重组型SMV与非重组型SMV基因组结构基本一致,但重组型SMV的P1端是由SMV和BCMV在P1编码区重组而来的。重组型SMV与非重组型SMV中的SC6亲缘关系最近,两者的致病性和侵染性是具有差异的,重组型SMV在大豆植株内更具有侵染性,而致病性则较Sc6弱。高质量的感染重组型SMV本氏烟cDNA文库的构建,为今后进一步研究重组型SMV的侵染机制奠定了物质平台。