第一部分:亮氨酸对胰岛β细胞的作用及机制研究:(AMPK)-(PDX-1)-(GCK/GLUT2)通路研究背景:近年来,随着社会经济的发展和生活水平的提高,2型糖尿病(T2DM)的发病率和患病率逐年提高,成为威胁人们生命和健康的主要社会问题。因此,深入探讨T2DM的病因及危险因素,对有效预防糖尿病(DM)的发生具有非常重要的意义。T2DM是遗传因素和环境因素长期作用的结果,胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是目前公认的发病机制的两个基本环节和特征。目前全球糖尿病患者已经超过2亿,且糖尿病发病率呈逐年上升趋势。步入上世纪90年代后,随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,环境因素对糖尿病的作用也引起人们更多的关注。高脂高热量饮食和肥胖成为影响糖尿病发病率和患者年龄结构改变的主要因素。当前这方面的研究主要集中于高血糖、高血脂对胰岛功能的影响,而高浓度氨基酸对胰岛功能的影响则研究很少。自1963年Floyd开拓性的工作以来,人们已经发现许多氨基酸在体内外具有促胰岛素分泌的作用。但由于实验设计方法的差异,每一种氨基酸的作用程度难以取得一致的结果,尽管如此,精氨酸,亮氨酸,谷氨酸已经证实与人及实验动物的胰岛素分泌有密切关系。但也有氨基酸对胰岛素分泌起抑制作用,目前的研究结果显示,半胱氨酸在胰岛B细胞中对胰岛素分泌起抑制作用.在糖尿病状态下,胰岛细胞遭到破坏,氨基酸代谢紊乱,补充外源性氨基酸是否可以作为改善糖尿病的有效途径?目前亮氨酸对胰岛功能的影响尤其是对葡萄糖刺激的胰岛素释放的作用,这方面的研究很多,但是存在着很大的争议。Yang等发现亮氨酸可以促进葡萄糖刺激的胰岛素释放,然而Anello等则在他们的实验中发现长期亮氨酸以剂量依赖方式抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放。并且,到目前为止,亮氨酸影响胰岛素释放和胰岛素含量的具体机制也尚未阐明。AMPK(AMP-activated Potein Kinase),即AMP激活的蛋白激酶,是新近发现的一种细胞内能量代谢的重要调节因子。其最主要的生物学效应是通过感受胞浆内AMP/ATP比值的变化,调节脂肪酸的氧化代谢。在胰岛β细胞,葡萄糖可通过氧化代谢直接改变细胞内的腺苷酸水平,从而影响AMPK活性,表现为高糖抑制AMPK表达和活性。此外,体外研究证实,精氨酸、亮氨酸和谷氨酰胺均可抑制AMPK活性,那么亮氨酸是否通过AMPK影响胰岛素分泌呢?PDX-1(Pancreas/Duodenum Homeobox-1),即胰腺十二指肠同源异型盒因子-1,是胰腺β细胞胰岛素基因的转录调控因子,此外,PDX-1还能转录胰岛素和调控胰岛素相关基因如葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)和葡萄糖激酶(GK)等的表达,对胰岛细胞内分泌功能起重要调节作用。而葡萄糖刺激β细胞释放胰岛素,首先必须经细胞膜EGLUT-2蛋白转运进入细胞内,在葡萄糖激酶作用下磷酸化,增加ATP/ADP比值,使胰岛素颗粒释放。大量实验研究显示AMPK(AMP激活的蛋白激酶)、PDX-1(胰腺十二指肠同源异型盒因子-1)与胰岛素分泌具有密切的关系,那么他们是否在亮氨酸影响胰岛功能的过程中发挥作用是我们研究的方向。因此,我们的实验旨在研究长期高浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量的影响,并且进一步研究其相关机制。目的:本研究利用体外培养的大鼠胰岛β细胞株(INS-1,RIN m5F,DN-PDX-1# 28and PDX-1# 6)在RPMI1640(10%FBS,50μMβ巯基乙醇)培养基中贴壁生长。不同类型的胰岛β细胞株以不同剂量亮氨酸(Leucine,L)为处理因素,以AICAR(A)为AMPK激动剂,Compound C(C)为AMPK阻断剂,对以下问题进行探讨:1.观察长期不同浓度亮氨酸培养对葡萄糖刺激的胰岛素释放功能和胰岛素含量的影响。2.观察长期高浓度亮氨酸对AMPK、PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA和蛋白表达的影响,探讨可能的机制。3.探讨在胰岛β细胞中,AMPK与PDX-1,GCK/GLUT2的关系。4.探讨在胰岛β细胞中,AMPK是否通过PDX-1影响GCK/GLUT2。5.观察长期高浓度亮氨酸是否通过(AMPK)-(PDX-1)-(GCK/GLUT2)通路影响高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。6.在大鼠INS-1细胞中检测长期亮氨酸培养24h对胰岛素释放,胰岛素含量,PDX-1以及其下游因子GLUT2蛋白的表达,并且探讨亮氨酸在抑制高糖刺激的胰岛素释放后,去除亮氨酸这个环境条件,是否能够再恢复。方法:1.INS-1和RIN m5F胰岛细胞株的培养和分组:INS-1与RIN m5F细胞在RPMI1640(添加10%FBS,2 mM L-谷氨酸,50μMβ巯基乙醇)培养基中贴壁生长。实验分为六组:C组,正常对照组;L组,40mM亮氨酸组;A组,0.5mMAICAR;C组,10μM Compound C;LA组,L与A共培养;PC组,P与C共培养。处理时间:48小时。DN-PDX-1# 28和PDX-1# 6胰岛细胞株的培养和分组:DN-PDX-1# 28 andPDX-1# 6细胞在RPMI1640培养基中培养,此外,还需添加100μg/ml潮霉素,100μg/ml G418和500 ng/ml的强力霉素。DN-PDX-1# 28和PDX-1# 6细胞分别在0.5 mM AICAR或者10μM Compound C中培养。2.INS-1,RIN m5F,DN-PDX-1# 28和PDX-1# 6细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能以及胰岛素含量的测定与评价:INS-1和RIN m5F细胞种于24孔板中,分组处理后,在葡萄糖浓度为3 mM、27.8 mM的KRB缓冲液分别孵育20min,收集上清,放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌(BIS)和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。3.细胞活力的检测:胰岛细胞株分组培养后,使用CCK-8方法检测细胞毒性。4.AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2的检测:在INS-1,RIN m5F细胞上,Real-timePCR检测AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA的表达;Western blotting检测AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2蛋白表达。5.RPMI1640培养PDX-1#6细胞株与PDX-1不表达的PDX-1#28细胞,加以强力霉素(Doxycyline),使PDX-1过表达以及不表达,RT-PCR检测AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 mRNA表达的变化:Western blotting检测AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2蛋白表达。结果:1.在INS-1与RIN m5F细胞中AICAR与Compound C的作用与正常组相比,AICAR活化后降低INS-1细胞中高糖刺激的胰岛素释放29%(P＜0.05)并且降低细胞内胰岛素含量30%P＜0.05);在RIN m5F细胞中,AICAR活化后降低细胞内胰岛素含量降低34%(P＜0.05)。当AMPK被Compound C抑制后,则起到相反的作用。与正常组相比,Compound C能够增加INS-1细胞高糖刺激的胰岛素释放17%P＜0.05)和INS-1细胞内胰岛素含量19%(P＜0.05)以及RIN m5F细胞25%(P＜0.05)。但是,无论是MCAR或者Compound C均不能影响INS-1细胞低糖(3mM)刺激的基础胰岛素释放(P＞0.05)。与对照组相比,AICAR明显增强p-AMPK蛋白表达,减弱PDX-1以及其下游GCK和GLUT2蛋白表达分别在INS-1细胞中(P＜0.05)和RIN m5F细胞中(P＜0.05)。与对照组相比,Compound C明显抑制AMPK活性,增强PDX-1,GCK以及GLUT2蛋白表达在INS-1(P＜0.05)和RIN m5F细胞中(P＜0.05)。Real-timePCR再次证实这些结果。与对照组相比,AICAR降低PDX-1 mRNA 38%和31%,GCKmRNA 21%和57%,GLUT2 mRNA by 51%和44%在INS-1(P＜0.05)和RIN m5F细胞中(P＜0.05);与对照组相比,Compound C增加PDX-1 mRNA 36%和55%,GCKmRNA 23%和24%,GLUT2 mRNA 30%和40%在INS-1(P＜0.05)和RIN m5F细胞中(P＜0.05)。2.在DN-PDX-1# 28细胞中AICAR与Compound C的作用在未用强力霉素诱导的条件下,PDX-1蛋白表达均很强,并且PDX-1蛋白表达在强力霉素诱导24h,48h或者72h没有显著差异(P＞0.05)。在500 ng/ml强力霉素诱导条件下,随着时间延长,PDX-1蛋白表达越来越弱,更近一步来说,最弱的条带出现在强力霉素诱导72小时组(P＜0.05)。与上述结果相对应,GLUT2与GCK与PDX-1一样有相似的结果。在未用强力霉素诱导的条件下,无论是24h,48h或者72h,GCK与GLUT2蛋白表达均没有显著差异(P＞0.05).在500 ng/ml强力霉素诱导24h,48h或者72h条件下,随着时间延长,GCK与GLUT2蛋白表达越来越弱(P＜0.05)。与正常组相比,单纯强力霉素组显著降低高糖刺激的胰岛素释放88%(Fig.3A1,P＜0.05),胰岛素含量82%(P＜0.05),and单纯Compound C组显著升高高糖刺激的胰岛素释放17%(P＜0.05),胰岛素含量19%(P＜0.05)。然而与单纯强力霉素组相比,强力霉素与Compound C共同培育组不能够显著影响胰岛素释放已经胰岛素含量(P＞0.05)。关于p-AMPK,PDX-1,GCK and GLUT2蛋白表达,在未用强力霉素诱导条件下,AICAR组或者Compound C组与上述在INS-1中所描述的或者RIN m5F细胞中Fig 1D所描述的一样。然而在强力霉素诱导条件下,p-AMPK蛋白表达与未用强力霉素诱导条件下蛋白表达没有显著改变(P＞0.05),关于PDX-1,GCK或者GLUT2蛋白表达,无论AICAR或者Compound C均不能够影响他们的表达(P＞0.05).上述结果再次用real-timePCR得到证实。3.不同浓度氨基酸在INS-1与RIN m5F细胞对胰岛素分泌的影响如Fig.4A与4B所示,我们的结果显示,当INS-1与RIN m5F细胞在不同浓度的亮氨酸中培育48h后,亮氨酸以剂量依赖方式抑制高糖刺激的胰岛素释放以及含量。与正常对照组相比,40 mM亮氨酸显著降低高糖刺激的胰岛素释放34%(P＜0.05),并且显著降低胰岛素含量24%(P＜0.05);但是对于低糖刺激的胰岛素释放没有显著影响(P＞0.05)。与正常对照组相比,10 mM或者20mM亮氨酸不能显著影响胰岛素释放(P＞0.05)和胰岛素含量在INS-1中(P＞0.05)。RIN m5F细胞所呈现的趋势与INS-1细胞一样,与正常对照组相比,40 mM亮氨酸显著降低胰岛素含量24%(P＜0.05)。Western blotting,real-time PCR方法被用来检测p-AMPK,PDX-1,GCK GLUT2。与正常对照组相比,40 mM亮氨酸显著增强p-AMPK蛋白表达在INS-1细胞中(P＜0.05)和RIN m5F细胞中(P＜0.05)。与正常组相比,40 mM亮氨酸显著降低PDX-1以及其下游指标GCK和GLUT2蛋白表达在INS-1(P＜0.05)和RIN m5F细胞中(P＜0.05)。与正常组相比,无论是10 mM还是20 mM亮氨酸均不能显著改变上述所说的蛋白表达在INS-1(P＞0.05)与RIN m5F细胞中(P＞0.05)。上述结果也被real-time PCR证实。4.亮氨酸在胰岛β细胞株中毒性检测结果显示,在INS-1,RIN m5F,DN-PDX-1#28和PDX-1#6 cells中,与正常组相比,10 mM亮氨酸培养的细胞活力分别为99%(P＞0.05),97%(P＞0.05),98%(P＞0.05),98%(P＞0.05),20mM亮氨酸培养的细胞活力分别为98%(P＞0.05),97%(P＞0.05),98%(P＞0.05),99%(P＞0.05),40 mM亮氨酸培养的细胞活力分别为97%(P＞0.05),97%(P＞0.05),96%(P＞0.05),95%(P＞0.05)。这些结果证明无论是10,20或者40mM亮氨酸对胰岛β细胞均没有细胞毒性作用。5.AICAR或者Compound C在长期亮氨酸培养条件下对INS-1和RIN m5F细胞的作用在INS-1和RIN m5F细胞中,单纯亮氨酸组,单纯AICAR组或者单纯Compound C组产生与Fig.1或者Fig.4相似的结果。此外,与单纯亮氨酸组相比,亮氨酸与AICAR共同培养组显著降低高糖刺激的胰岛素释放21%在INS-1中(P＜0.05),降低细胞内胰岛素含量23%在INS-1中(P＜0.05),and26%在RIN m5F cells中(P＜0.05)。更进一步,长期亮氨酸培养后引起高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量降低,亮氨酸与Compound C共同培养可以显著恢复降低的高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量。与单纯亮氨酸组相比,亮氨酸与Compound C共同培养显著增加高糖刺激的胰岛素释放33%在INS-1细胞中(P＜0.05),增加胰岛素含量24%在INS-1细胞中(P＜0.05),29%在RIN m5F中(P＜0.05)。与正常组相比,无论AICAR或者Compound C均不能显著影响低糖刺激的胰岛素释放(P＞0.05)。与正常组相比,PDX-1,GCK和GLUT2在单纯40 mM亮氨酸组以及单纯AICAR组呈现出弱条带,在40 mM亮氨酸与AICAR共同培养组呈现最弱条带(P＜0.05)。高亮氨酸引起PDX-1,GCK和GLUT2蛋白表达降低,亮氨酸与Compound C共同培养组能够恢复降低的蛋白(P＜0.05)。上述结果被real-time PCR再次证实在INS-1(Fig.6D1)和RIN m5F细胞中。6.不同浓度亮氨酸对胰岛素释放、胰岛素含量、以及胰岛β细胞蛋白的影响我们的研究结果显示不同浓度的氨基酸培养24小时以剂量依赖形式抑制高糖高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量,40 mmol/l亮氨酸引起的作用最明显。与正常组相比,40 mmol/l亮氨酸显著抑制高糖刺激的胰岛素释放11%(P=0.026),胰岛素含量14%(P=0.008),但是对低糖刺激的胰岛素释放没有显著作用(P=0.01)。与正常组相比,无论是10 mmol/l还是20 mmol/l亮氨酸均不能显著影响胰岛素释放(P=0.645 or P=0.250)和胰岛素含量(P=0.870 or P=0.279)。随着亮氨酸浓度的增加,PDX-1蛋白条带变得越来越弱,并且与正常组相比,40 mmol/l leucine亮氨酸组显著抑制PDX-1蛋白表达(P=0.013)。此外,GLUT2蛋白表达跟PDX-1蛋白表达趋势一样,最具有显著差异的条带出现在40mmol/l亮氨酸组(P=0.011)。7.24h恢复后对胰岛素释放、含量以及胰岛β细胞蛋白表达的影响结果显示与正常组相比,40 mmol/l亮氨酸培养24h显著降低高糖刺激的胰岛素释放11%(P=0.026)和胰岛素含量14%(P=0.008),并且40 mmol/l亮氨酸培养48h显著降低高糖刺激的胰岛素释放22%(P=0.003)和胰岛素含量20%(P=0.002)。当亮氨酸预培养24h后再去除亮氨酸在普通培养基中继续培养24h,与那些在亮氨酸培养基中培样24h或者48h,高糖刺激的胰岛素释放升高13%(P=0.032)或者27%(P=0.002),胰岛素含量升高10%(P=0.014)或者20%(P=0.003)。与正常组相比,亮氨酸培养降低PDX-1和GLUT2蛋白表达,亮氨酸培样48h组最明显。亮氨酸培养24h后降低的PDX-1和GLUT2蛋白表达在去除亮氨酸后继续培养24h后可以基本恢复到正常(P=0.013;P=0.015)。与亮氨酸培养48h组相比,经过24h恢复培养后的PDX-1和GLUT2蛋白条带显著增强(P=0.005;P=0.006)。结论:1.理下的胰岛细胞株中,AMPK可以调节GCK/GLUT2的表达,并且这种调节可能是通过PDX-1发挥作用的。2.氨基酸环境,同样存在着AMPK通过PD-1调节GCK/GLUT2.3.长期高浓度亮氨酸培养可以活化AMPK,然后降调PDX-1以及其下游因子GCK与GLUT2 mRNA和蛋白的表达,最终抑制高糖刺激的胰岛素释放以及胰岛素含量。4.亮氨酸培养24h以剂量依赖方式抑制高糖刺激的胰岛素释放和胰岛素含量在INS-1细胞中,并伴随PDX-1以及其下游因子,GLUT2蛋白的降低。并且亮氨酸培养24h后降低的高糖刺激的胰岛素释放,胰岛素含量以及PDX-1和GLUT2蛋白表达在去除亮氨酸后继续培养24h后可以基本恢复到正常。