目的 支气管哮喘是世界范围内严重危害人类健康的慢性疾病，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，因此，深入研究其发病机制、寻找选择性治疗支气管哮喘的特效药物是医药学界的重大课题。滨蒿内酯(Sco)是传统中药茵陈蒿或滨蒿中的有效成分之一，对气管平滑肌(TSM)具有强大的舒张作用，具有开发为有效平喘药物的潜力。本研究一方面对从沈阳地产滨蒿提取Sco的方法和收率进行考察；另一方面从Ryanodine受体介导内钙释放途径和Th1／Th2类因子失衡学说入手，在离体、在体及分子水平上对支气管哮喘机制进行研究，同时探讨Sco的平喘作用机制，为开发行之有效的平喘药物提供药理学依据。 方法 Sco的提取方法 取滨篙花穗或全草，阴干，剪碎(种子、果实直接用水或有机溶剂浸渍)40℃-80℃溶剂浸两次(4h、3h)，浸出液合并，减压浓缩。浓缩液以氯仿萃取，氯仿萃取液浓缩到较小体积。先5％碳酸钠水溶液萃取除去羧基酸性成分，然后再以2％氢氧化钠水溶液萃取除去酚性成分。最后再以水洗，除去水分，回收氯仿至干。残渣以甲醇加热溶解，冷却，放置，析出白色针状结晶即为Sco，收集结晶，干燥，即得。 动物分组及处理因素 健康豚鼠，体重150-200g，雌雄各半(由辽宁中医学院实验动物中心提供)。随机分成生理盐水对照组(A组)、哮喘发作组(B组)和Sco治疗组(C组)。从实验第1天开始至第28天对C组每日雾化吸入0.034％Sco生理盐水溶液2分钟(该浓度为Sco的最大水溶剂量，哮喘抑制率为90％)。A、B两组以同样方式给予生理盐水。 哮喘豚鼠模型的建立 B组和C组：腹腔注射10％卵蛋白生理盐水溶液1ml致敏，2周后每日一次，每次2分钟，给予1％卵蛋白生理盐水超声雾化吸入以诱发哮喘，共两周。喷雾时观察豚鼠反应，以出现抖动，节律性点头呼吸，呼吸频率加深加快，腹肌抽搐等为阳性反应，提示造模成功。激发不成功或过敏性休克死亡者淘汰。A组除用生理盐水代替卵蛋白生理盐水外，其余操作均与B、C组相同。末次激发结束后24小时内取材。 离体豚鼠气管环制备及张力测定棒击法处死豚鼠后迅速开胸，取出其主气管置于冷的通有混合气体(95%0:，5%CO:)的Krebs一Henseleit(K-H)营养液中，剪除气管周围的结缔组织及脂肪组织，将其剪成3一~左右的气管环，悬挂于盛有10祖K一H液的浴管中，保持温度37土0.5℃，并持续通人混合气体。气管环的张力变化可通过其上端相连的力一位移换能器记录在台式平衡记录仪上。标本初始负荷为29，每20而n换一次营养液，平衡Zh后向浴管中加人试验药物。在每次试验开始时，重复应用60mM KCI溶液直至获得稳定的收缩反应方可进行试验。 RT一PCR方法对豚鼠巧MC上殉R亚型的鉴定棒击法处死豚鼠后在无菌条件下迅速开胸，取出完整肺组织，剥离主气管并分离其外周结缔组织及脂肪组织，刮除气管粘膜及粘膜下层后，分离两侧的软骨，取出气管平滑肌，同样无菌条件下留取骨骼肌、心、脑组织作为RyRI、RyRZ及价R3的阳性对照;用Trizol试剂提取气管平滑肌的总RNA，采用RT一PCR方法扩增RyR三个亚型的cDNA产物，以确定仆MC上的舜R的亚型表达。引物设计参照Neylon和Richard等的实验，引物片段由Takara公司合成，RyRI引物为:5’一GAAGG叨陀TGGACAAACACGGG召’;5气TcGCTCTTGTI心.TAGAA明[T GCGG一’;脚R2引物为:5气GAATCAC飞AGTTACTGGGCAT.GG一3’;5’一CTGGTCTcTGAg汀CTCCAAAAGC一3’;衍R3的引物为:5’一CCT-TCGCTATCAAC竹CATCCTGC一’;5’一TCTrCTACTGGGCTAAAGTCAAGG-3’。扩增片段长度分别为435、635和SO5bp。RT的反应条件为:65℃lmin，30℃smin，匀速升温至65℃30而n，98℃5而n，5℃5而n;PCR反应总体积为25闪，反应条件为:94℃预变性Zmin后，以94℃305，57℃305，72℃2而n的顺序，共30个循环，最后72℃延伸smin。产物经1 .5%琼脂搪凝胶电泳后，澳化乙锭染色，并在凝胶成像分析系统进行拍照、分析。 哮喘豚鼠气管平滑肌街RZ mRNA水平变化及Sco影响的分析采用RT一PCR方法对三组豚鼠飞MC的舜R2亚型的mRNA表达水平进行半定量分析，以(一actin的cDNA扩增产物作为内参照，p一actin的引物序列为:5’.TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC召’;5’一ACAGAGTAO[T GCGCTCAGGAG-3’;扩增片段长度为592bp。反应条件及反应体系同上。RT，PCR的cDNA扩增产物经1 .5%琼脂糖凝胶电泳后，澳化乙锭染色，用凝胶成像分析系统分别对目的基因价咫及p一actin扩增产物的条带密度进行扫描测定，计算价R2/p一actin扩增产物的密度比值，以反映价R的mRNA含量，并进行组间比较。 豚鼠血清与肺组织匀浆制备末次喷雾激发后24h内，20%乌拉坦1 .25扩kg腹腔注射麻醉动物。于麻醉状态下，直视下心脏取血4耐，注人试管中，待凝固后分离，以4℃巧oo转离心10分钟，取上清;取出肺组织，吸去血迹，称取Zmg组织，尽快放人生理盐水1而研磨，然后在100℃水浴中煮沸10分钟，匀浆，4℃3《XX)rpm离心15分钟，取上清。 I薛、IL4和IFN一，含量的测定I薛采用化学发光法测定，IL4采用放免法测定，IF’N一，采用ABC一El