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背景与目的肿瘤干细胞是肿瘤中的特殊细胞亚群,具有自我更新能力及多向潜能性,可能从肿瘤细胞去分化重编程而来,是肿瘤临床治疗失败的重要原因。脱氧胆酸(DCA)是胃食管反流内容物的成分之一,在诱导食管鳞状上皮细胞转变成Barrett食管中起重要作用。Barrett食管是食管腺癌的癌前病变,考虑到食管腺癌生长在脱氧胆酸刺激的炎症环境下,本实验预探讨脱氧胆酸是否能影响重编程因子KLF4、OCT4、Nanog的表达,对食管腺癌细胞有食管腺癌干细胞转化的恶性诱导作用,且常见的IL-6/STAT3炎症信号通路是否参与该过程的调节。研究方法1、使用浓度为250uM的DCA分别刺激食管腺癌OE33细胞株Oh、3h、6h、12h,通过RT-PCR检测重编程因子KLF4、OCT4、Nanog、细胞因子IL-6、凋亡蛋白Bcl-xL的mRNA表达水平;采用ELISA检测细胞培养基上清液中IL-6蛋白水平;使用Western Blot检测STAT3、pSTAT3、KLF4、OCT4蛋白表达状况。2、运用小干扰RNA沉默STAT3,使用RT-PCR和Western Blot法检测KLF4、OCT4、Bcl-xL的mRNA和蛋白表达变化,探讨STAT3和KLF4、OCT4、Bcl-xL的上下游调控关系。3、使用重组人IL-6(rhIL-6)刺激食管腺癌OE33细胞株24h,通过RT-PCR和Western Blot法检测pSTAT3、KLF4、OCT4、Bcl-xL的mRNA和蛋白表达变化,进一步明确IL-6/STAT3信号通路的参与调控作用。结果1、DCA刺激食管腺癌细胞,相较于刺激Oh,细胞重编程因子KLF4在DCA刺激3h、6h、12h后,mRNA相对表达量分别是1.87、6.34(P<0.01)、4.57(P<0.05)倍,DCA刺激Oh、3h、6h、12h的KLF4蛋白相对表达量分别为0.78、0.89、1.79(P<0.05)、2.73(P<0.05);OCT4在DCA刺激3h、6h、12h后基因mRNA相对表达量上升达1.43、1.87(P<0.05)、4.51(P<0.01)倍,刺激Oh、3h、6h、12h的OCT4蛋白相对表达量为0.53、0.70、1.87(P<0.05)、2.36(P<0.05);Nanog在DCA刺激3h、6h、12h后mRNA相对表达量为1.65、0.97、1.14倍,均无明显统计学差异;抗凋亡蛋白Bcl-xL在DCA刺激3h、6h、12h后,mRNA表达量是DCA刺激Oh组的2.16、2.31(P<0.05)、5.38(P<0.05)倍;细胞因子IL-6的mRNA相对表达量在DCA刺激3h、6h、12h后分别是1.82、6.11(P<0.01)、26.66(P<0.01)倍,对应的培养基上清液IL-6分泌蛋白的浓度分别为8.029ng/L、17.004ng/L、20.532ng/L,与DCA刺激Oh相比均有统计学差异(P<0.01);Western Blot图显示出IL-6下游的信号蛋白pSTAT3(Tyr705)随着DCA刺激时间的延长,表达明显逐渐增加。2、食管腺癌细胞沉默STAT3后,干细胞重编程因子KLF4、OCT4及抗凋亡蛋白Bcl-xL的mRNA相对表达量分别下调至13%(P<0.01)、34%(P<0.05)、37%(P<0.01);沉默STAT3前后KLF4蛋白的相对表达量分别是0.89、0.57(P<0.05),OCT4蛋白的相对表达量分别是2.87、1.86(P<0.01),KLF4、OCT4蛋白表达在沉默STAT3前后均有显著性差异,表明STAT3是KLF4、OCT4、Bcl-xL基因表达的上游调控分子,能促进它们表达。3、重组人IL-6刺激食管腺癌细胞,Western Blot图显示了 pSTAT3(Tyr705)蛋白表达上调呈现rhIL-6浓度依赖性。相较于空白对照组blank,10ng/ml、100ng/ml浓度的rhIL-6处理细胞24h后,KLF4基因mRNA相对表达量分别为1.62、3.36倍(P<0.05),OCT4基因mRNA相对表达量分别是2.65、3.87倍(P<0.05);blank、10ng/ml、100ng/ml处理组KLF4蛋白的相对表达量分别是0.76、3.25(P<0.01)、3.72(P<0.05),OCT4蛋白的相对表达量分别是2.74、5.08(P<0.01)、7.86(P<0.01),重组人IL-6刺激KLF4、OCT4蛋白表达有统计学意义。同时,Bcl-xL基因mRNA相对表达量在10ng/ml、100ng/ml浓度的rhIL-6处理细胞24h后,分别上升至为1.15倍、7.01倍(P<0.05)。结论脱氧胆酸具有毒性诱导作用,激活了 IL-6/STAT3通路,促进干细胞标志物KLF4、OCT4和抗凋亡Bcl-xL上调表达,可能诱导食管腺癌细胞向肿瘤干细胞转化,并提高肿瘤的抗凋亡能力,增加食管腺癌的恶性程度。靶向IL-6/STAT3信号通路和中和脱氧胆酸,或许能抑制食管腺癌肿瘤干细胞的形成,帮助提高食管腺癌的临床疗效。