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背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是动脉壁上聚集了脂质、细胞外基质和炎症细胞的一种慢性炎症性疾病。研究表明,很多种细胞,包括巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)参与AS的形成。了解AS发生发展的分子及细胞学机制,将有助于预防和治疗AS所导致的临床心脑血管事件的发生。人的E1A激活基因阻遏子(CREG)是含有220个氨基酸的糖蛋白,在缺少维甲酸等诱导剂的条件下,CREG能通过拮抗E1A诱导的转录激活和细胞转化,抑制人的胚胎瘤细胞增殖和VSMC的表型转化,并促进其成熟分化。PCI术后再狭窄和AS疾病均有VSMC的迁移和增殖等病理性细胞行为参与其中。而以往本室研究已证明,CREG作为一种保护因子通过拮抗VSMC的迁移和增殖等表型转化的生物学行为,抑制了PCI术后再狭窄。然而,CREG对AS中VSMC表型转化的调控作用研究尚未见报道。目的:探讨CREG在AS发生、发展中对VSMC表型转化的调控作用和分子机制。方法:1.标本(1)人的AS血管来源于截肢手术的糖尿病病人,正常血管来源于器官捐赠者。(2)新西兰大白兔给予正常喂养和高脂喂养1月或者2月。高脂饲料:1%胆固醇,10%脂肪,10%蛋黄粉。白兔麻醉后取主动脉根部血管。(3)apoE(-/-)小鼠购自北京大学动物实验中心,8周龄断奶后给予高脂喂养(添加21%脂肪和0.25%胆固醇)。2.免疫组化和免疫荧光染色(1)石蜡切片的免疫组化:组织分离后,PBS清洗,浸入4%福尔马林溶液,4℃过夜。固定的组织按酒精梯度脱水,石蜡包埋。切成5μm厚的切片,烤箱烘干后脱蜡,按梯度酒精复水。切片用3%甲醛过氧化氢孵育30min,去除内源性过氧化物酶。然后在室温下用4%小牛血清(BSA)孵育60min,阻断非特异性抗体。加入1:100的一抗(抗CREG,SMαactin,SM MHC和CD31抗体),4℃过夜;PBS清洗后加入1:150稀释的二抗90min,PBS清洗后用0.05%DAB染色2min,苏木素复染,脱水、透明后封片。光学显微镜照相。(2)冰冻切片的免疫荧光:组织分离后于4%多聚甲醛浸泡30min,7.5%蔗糖PBS脱水过夜。将组织包埋于OCT中冷冻,而后切成5μm的冰冻切片,3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶;4% BSA封闭后加入一抗及带有荧光标记的二抗,在荧光显微镜下观察,拍照。3.VSMC培养VSMC来源于心脏移植手术中人的非AS动脉,经胰酶消化后的VSMC在10%胎牛血清(FCS)DMEM中培养传3-5代。VSMC经传代后种植于0.4% FCS的DMEM中培养48h,添加100μg/mL oxLDL刺激不同时间点。如果用阻断剂时,将ERK阻断剂提前加入细胞培养皿中,30min后给予100μg/mL oxLDL刺激。4.蛋白纯化和western blot分析细胞和组织匀浆在裂解液中裂解后,15 000g离心10min收集上清,测定总蛋白浓度。蛋白经浓缩胶、分离胶电泳后,转移至PVDF膜。加入一抗及带有HRP的二抗,添加ECL试剂盒中的荧光剂,曝光显影。5.AS斑块定量分析将HE染色及油红染色的照片经Image-pro plus 6.0软件系统分析,计算斑块面积所占的百分比。6. ELISA分析上清中的TNF-α和IL-1β细胞经oxLDL刺激后,在指定时间点收集上清,按ELISA试剂盒说明书操作,定量分析TNF-α和IL-1β含量。结果:1.CREG在AS血管中表达下调(1)新西兰白兔高脂喂养1-2月,动脉血管行免疫组化染色,发现高脂喂养1月时血管内膜开始增厚,内膜细胞增生活跃。与对照组相比,VSMC标志蛋白SMα-actin和SM MHC表达下降,同时CREG表达也下调。Western blot分析显示,与正常对照组相比较,CREG在高脂喂养的AS血管中表达明显下调。(2)在人的AS血管中,CREG无论在内膜还是在中膜,表达均明显下降,同时VSMC标志物SMα-actin和SM MHC也下降。(3)在apoE(-/-)小鼠高脂喂养2周内,CREG在动脉血管中的表达不是降低,而是明显升高,高脂喂养第4周CREG表达急剧下降,而后又逐渐上升,但不能升至正常水平。同时核转录因子NF-κB随着时间的推移,表达逐渐升高。2. oxLDL刺激VSMC下调CREG,过表达CREG抑制VSMC增殖(1)oxLDL刺激VSMC12~24h后,CREG蛋白表达降低,同时SMα-actin和SM MHC表达也下降,P-ERK1/2表达却上调。在CREG低表达组(CREG-DOWN)细胞给予ERK阻断剂PD98059 (50μmol/L)后再添加oxLDL,细胞增殖受到抑制。经oxLDL刺激24h,CREG正常表达(CREG-NR)组的细胞数量明显多于CREG高表达(CREG-UP)组,而CREG-DOWN组细胞数量又明显高于CREG-NR组。Brdu阳性细胞数在CREG-DOWN组最多,其次为CREG-NR组,CREG-UP组最少。这表明:CREG过表达明显抑制VSMC增殖,而CREG低表达则促进了VSMC的增殖。3. CREG过表达抑制NF-kB p65核转位,降低了TNF-α和IL-1β分泌(1)在三组细胞中,血清饥饿后添加100μg/ml oxLDL刺激12~24h,提取核蛋白后行western blot检测NF-kB p65。在CREG-NR组细胞中,核内NF-kB表达明显增多,在CREG-UP组细胞中NF-kB表达仅轻度上升,而CREG-DOWN组细胞中,NF-kB表达明显高于其他两组,均有显著差异(P<0.05)。同时应用ELISA方法检测三组上清中分泌TNF-α和IL-1β的变化。经刺激24h,三组细胞分泌的TNF-α和IL-1β有明显差异,CREG-UP组细胞上清中分泌TNF-α和IL-1β明显少于其他两组(P<0.05)。4.体内过表达CREG能够减缓AS进程apoE(-/-)小鼠高脂喂养8周后,将带有CREG和GFP的腺病毒(AD-GFP-CREG)4.75×1010pfu经尾静脉注入体内,只带有GFP的腺病毒(AD-GFP)作为对照,继续给予6周高脂喂养。注射后1~5周在动脉血管壁上均可检测到外源性CREG和GFP蛋白。在1~2周时CREG和GFP表达逐渐增高,并在2周时达到高峰,而后CREG和GFP组表达逐渐降低。HE染色和大体油红染色均显示AD-GFP-CREG组AS斑块的面积明显小于对照组(P<0.05)。除此之外,NF-κB及TNF-α水平在AD-GFP-CREG组也明显低于对照组(P<0.05)。结论:CREG通过逆转VSMC表型转化,抑制增殖和炎症因子的释放,延缓了AS的进展。