基因组DNA通常都被认为具有典型的右手双螺旋B型DNA结构，但其实它们也可以形成其他结构。G-四链体(G-quadruplex) DNA结构最早报道于1962年，就是非B-型DNA中的一种，，但其一直没有引起人们的注意。直到20世纪90年代，人们陆续发现基因组中有许多具有重要生物学功能的区域如端粒、免疫球蛋白开关区、一些重要基因如人的肾抑癌基因和c-myc基因启动区以及与人类某些疾病有密切关系的序列，都富含鸟嘌呤碱基(G)，并且这些序列在体外能形成特殊的G-四链体结构，其新颖的结构类型和重要的生物学功能才引起了人们极大的兴趣并成为研究热点。　　G-四链体DNA是由富含G的DNA单链在特定的离子强度和pH条件下，通过单链之间或单链内对应的G碱基之间形成Hoogsteen氢键来配对，从而使四条或四段富含G的DNA片段聚集而形成的。其基本结构单位是G-四分体(G-quartet)它由四个鸟嘌呤在一个平面内以氢键环形连接而成，每一个G既是氢键的受体也是配体。G-四分体平面层层堆叠，通过纵向的疏水键相互作用，同时四分体之间是可以相互扭转的，形成螺旋结构。　　研究最多也是最简单的四链体结构是在1992年Bock等人发现的，由15个碱基d（GGTTGGTGTGGTTGG）组成的凝血酶适体(Thrombin Binding Aptamer，TBA)在形成椅式构象后能高亲和性地结合凝血酶并抑制其活性，是很有潜力的治疗血栓栓塞性疾病的药物分子。中心阳离子的存在对于TBA结构的形成是至关重要的，但是并非所有的阳离子在稳定G-四链体方面都是等效的，这与各种阳离子的离子半径有关系，一价阳离子的稳定顺序K+＞＞Na+＞Rh+＞NH4+＞Cs+，二价阳离子的稳定顺序是Sr2+＞＞Ba2+＞Ca2+＞Mg2+。钾离子在细胞内是非常丰富的，这对G-四链体的形成是很有利的，也有研究证明了这一点。二价阳离子Sr2+，Ba2+并非体液环境中必需的离子成分，Ca2+在一切细胞的运动、分泌、代谢、分化等基本过程中，它都起着偶联和/或第二信使的作用。　　然而天然寡核苷酸在体内极易被核酸酶降解，而表现出极大的不稳定性，从而限制了其在基因功能研究和药物研发领域的应用。在其他类型的核酸的研究中表明，这个问题可以通过对它进行适当化学修饰得以改善，修饰后的寡核苷酸稳定性和抗降解能力增强，从而在血浆中稳定存在的时间也明显延长。然而核苷酸残基修饰物在G-四链体的研究中却不多见，在K+和Ca2+溶液环境中对修饰后的TBA的构象变化的比较以及进一步影响TBA与凝血酶的相互作用的系统研究更是未见报道。　　本研究拟采用对TBA的不同位置、不同数量的鸟嘌呤核苷酸残基的戊糖环2位置分别进行甲氧基(2-O-Methyl)和氟(2-F)的取代，并在不同的离子条件下(K+或Ca+)，对TBA系列物的空间构象进行研究，并进一步从生物功能角度对它们与凝血酶的结合能力发生的变化进行检测。本研究的目的是检测特定修饰对TBA稳定性的影响，更好地探索能够影响它们的形成和稳定性的因素，对于新型G-四链体治疗试剂的发展，以及对这些结构在其他领域的探索都是很有帮助的。　　实验方法:　　1、寡核苷酸样品的准备　　本实验所用核苷酸片段均由宝生物工程（大连）有限公司合成，普通核苷酸纯度为OPC纯化级，2-O-Methyl和2-F修饰的核苷酸纯度为HPLC纯化级。纯化的核苷酸片段用TE缓冲液(pH7.4)稀释至0.1mmol/L，均分后置于-20℃冰箱中保存。　　2、圆二色谱(CD)检测分析　　该方法是最常用的定性分析G-四链体结构的检测手段，典型的反平行G-四链体在295nm左右有一明显正峰，在260-265nm附近有一明显负峰，而平行结构的G-四链体在265nm左右有一明显正峰，在240-245nm附近有一明显负峰。因此可以通过CD光谱的曲线变化判断G-四链体的结构变化。CD光谱在JASCO-810型CD光谱仪（配备变温度附件）上进行测定，采用1mm样品池，在220-340nm范围内扫描，扫描速度是500nm/s，平行扫描3次。　　3、紫外吸收及熔解曲线分析　　Varian Cary100型紫外分光光度计测定G-四链体及其系列样品结构的熔解曲线，软件处理得到解链温度。　　4、热动力学参数分析　　紫外分光光度计测定得到的熔解曲线，通过机器自带软件处理得到热动力学参数，并对这一系列参数进行分析。　　5、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析　　通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，为上面几种方法得到的数据和分析结果提供参考，根据条带迁移的位置，也能观察到G-四链体结构的改变。　　6、凝血酶凝血时间(TT)检测实验　　应用解放军202医院血液检测中心的法国Stago公司全自动凝血分析仪(Diagnostica Stago STA-R Evolution)对凝血酶凝血时间(TT)进行检测，观察G-四链体结构变化对凝血酶作用的影响。　　实验结果:　　1、2-O-Methyl修饰的TBA在K+溶液环境中构象的变化:　　在K+溶液环境中，2-O-Methyl对TBA进行修饰时，我们分别选取了单位点、双位点、一个G4-平面和两个G4平面的鸟嘌呤核苷酸(G)。单位点修饰M1(2)和M1(11)，构象基本不发生变化;而M1(5)或者M1(14)，结构发生明显改变。双位点修饰、一个G4-平面以及两个G4平面的系列样品，基本完全失去原有反平行G-四链体结构。　　2、2-O-Methyl修饰的TBA在Ca2+溶液环境中构象的变化:　　在Ca2+溶液环境中，观察到的结果是单位点和双位点修饰的系列均失去原有结构。而一个G4-平面和两个G4平面修饰的M4和M8却有向正平行转变的现象出现，并且M8在265nm附近还出现较高的正峰。　　3、2-F修饰的TBA在K+溶液环境中构象的变化:　　在K+溶液环境中，2-F对TBA进行修饰时，F1(2)和F1(11)，反平行构象不变，结构明显与TBA相似，甚至更稳定;F1(5)原构象已经松散，F1(14)虽也与TBA相似，但稳定性已经下降。双位点修饰、一个G4-平面以及两个G4平面的系列样品，基本完全失去原有反平行G-四链体结构。　　4、2，-F修饰的TBA在Ca2+溶液环境中构象的变化:　　在Ca2+溶液环境中，观察到的结果是单位点修饰全部失去原有结构，双位点修饰虽失去原TBA构象，但在F2(2，11)和F2(11，14)却出现向正平行转变的趋势。而一个G4-平面和两个G4平面修饰的F4和F8却有向正平行转变的现象出现，并且F8在265nm附近还有较高的正峰。　　5、对TGT环进行2-O-Methyl修饰后的结构特点:　　甲氧基对TGT环的单位点修饰:在K+溶液环境中，并未发现有结构上的明显变化;在Ca2+溶液环境中，原有结构全部瓦解。　　6、对TGT环进行2-F修饰后的结构特点:　　氟元素对TGT环的单位点修饰:在K+溶液环境中，并未发现有结构上的明显变化;在Ca2+溶液环境中，原有结构全部瓦解。　　7、构成G-四链体的鸟嘌呤核苷酸被修饰后对凝血酶作用的影响:　　鸟嘌呤核苷酸残基被甲氧基修饰的系列中，无论是在K+还是Ca+溶液环境中，与TBA相比，均有凝血酶凝血时间的减少。而在氟元素修饰的系列中，无论是在K+还是Ca2+溶液环境中F1(2)，F1(11)和F2(2，11)与凝血酶作用得到的凝血酶凝血时间均超过TBA。　　8、 TGT环进行修饰后对凝血酶作用的影响:　　在K+溶液环境中，除了TBA-F-G8凝血酶凝血时间长于TBA，其他样品凝血酶凝血时间与TBA相比均减少。而在Ca2+溶液环境中，则均超过了240秒（凝血分析仪测量的最大值）。　　结论:　　1、离子环境的影响:　　溶液的离子环境对TBA的反平行G-四链体构象具有很大的影响，TBA的反平行G-四链体像一个“口袋”，离子半径以及离子的结合方式都会改变四链体的空间构象，因此在K+或Ca2+存在时，TBA的构象会发生不同的变化。　　2、核苷酸残基戊糖环2-位置的不同修饰:　　对核苷酸残基戊糖环2-位置的修饰，由于取代集团甲氧基和氟中的氧原子和氟原子电负性不同，同时吸电子诱导效应也不同，对糖环折角和糖苷键扭转角的改变方式也有所不同，因此在两种修饰方式中，也表现出不同的的构象特点。　　3、与凝血酶作用的生物学功能:　　对G-四分体上不同鸟嘌呤核苷酸进行不同方法修饰后，在不同离子环境中得到的凝血酶凝血时间各不相同，其变化也是与构象的改变有直接关系的。由于TGT环在TBA中是离子进出的“门”，所以对其也进行了修饰，不同位点的不同基团的修饰，使其与凝血酶的作用后测得的TT值也有了不同改变。