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目的阿尔茨海默氏症(Alzheimer disease,AD)是最常见的一种神经退行性疾病,也是老年人最常见的脑疾病之一,其主要病因是β-淀粉样肽(Aβ)的沉积异常,高度磷酸化tau蛋白集聚形成的神经元内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)以及神经元丧失与突触改变。加兰他敏,目前在治疗AD中的一线药物,已被证明能有效减少Aβ诱导的神经毒性和具有良好的神经保护作用,但具体机制尚不清楚。本研究将阐明加兰他敏抑制Aβ诱导的PC12细胞自噬的分子机制,为更深一层解析AD的病理进程和临床治疗AD提供理论依据和实验基础。方法(1)采用MTT和克隆形成实验方法,探究加兰他敏对Aβ诱导的PC12细胞毒性的影响。(2)通过免疫印迹和免疫荧光实验,探究加兰他敏对Aβ诱导的PC12细胞自噬的作用。(3)运用TUNEL和Hoechst染色以及免疫印迹方法,分析检测加兰他敏对Aβ诱导的PC12细胞凋亡的作用。(4)采用免疫印迹和二氯二氢荧光素探针(DCFH-DA)的方法,探究加兰他敏如何影响NOX4的表达和ROS的产生进而抑制Aβ诱导的PC12细胞自噬。(5)采用免疫组织化学技术,从动物水平分析加兰他敏对Aβ介导的神经元毒性损伤的影响。结果(1)加兰他敏有效逆转Aβ诱导的PC12细胞毒性作用。MTT实验结果显示,Aβ处理PC12细胞24 h后抑制细胞活力,并与Aβ呈浓度剂量依赖性,其IC50值约2μmol/L。加兰他敏处理24 h后有效减弱Aβ诱导的PC12细胞毒性作用,且40μmol/L加兰他敏效果最为明显。此外,克隆形成实验也表明加兰他敏能有效逆转Aβ导致的PC12细胞增殖抑制。(2)加兰他敏抑制Aβ诱导的PC12细胞自噬。免疫印迹和免疫荧光实验结果表明,Aβ处理PC12细胞24 h后导致细胞自噬流和自噬体的形成,且加兰他敏有效抑制这种Aβ诱导的PC12细胞自噬。(3)加兰他敏抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡。通过TUNEL检测细胞凋亡率发现,Aβ显著诱导PC12细胞凋亡,加兰他敏在一定程度上能其诱导的凋亡。采用Hoechst 33342染细胞核评估细胞凋亡的水平,结果发现细胞核显示出高度浓缩和呈碎片样形态,经过40μmol/L加兰他敏共处理后,细胞和浓缩和凋亡的数量有所减少。此外,通过免疫印迹检测caspase-3的活化情况,实验结果与TUNEL检测和Hoechst染色结果一致。证明加兰他敏能有效抑制Aβ诱导的PC12细胞损伤性自噬。(4)加兰他敏通过抑制NOX4的表达和ROS的产生进而抑制Aβ诱导的PC12细胞自噬。通过DCFH-DA荧光探针和免疫印迹检测胞内ROS的产生和NOX4的表达,结果数据显示Aβ诱导PC12细胞内ROS水平的增加和NOX4的表达上调,而加兰他敏显著抑制Aβ介导的ROS增加和NOX4表达上调。当另外加入LPS共孵育细胞后,LPS能在一定程度上解除加兰他敏对Aβ诱导的PC12细胞自噬抑制作用。ROS清除剂NAC作为阳性对照,和加兰他敏的作用效果一致。结果表明加兰他敏通过抑制NOX4的表达和ROS的产生进而抑制Aβ诱导的PC12细胞自噬。(5)动物实验评价加兰他敏通过抑制Aβ介导的自噬起到的神经元保护作用。采用免疫组织化学技术检测大鼠动物模型大脑皮层海马组织中自噬相关蛋白质标志物(LC3,Beclin-1等)以及神经元损伤标志物神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的变化情况。结果显示,加兰他敏能有效抑制Aβ介导的LC3和Beclin-1等的表达,并且加兰他敏还能显著抑制Aβ介导神经元毒性损伤,即加兰他敏抑制Aβ介导的NSE的表达,结果表明加兰他敏通过抑制Aβ介导的自噬起到神经元保护作用。结论加兰他敏通过抑制NOX4的表达进而抑制ROS的累积最终抑制Aβ诱导的PC12细胞损伤性自噬,对神经元起到神经保护作用,为更深层次解析加兰他敏的神经保护机制和AD的病理进程提供新的见解和思路。