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致命鹅膏是中国特有剧毒蘑菇,目前仅在广东发现。近年来广东因误食该菌中毒死亡人数占毒蘑菇中毒死亡总人数的90%以上,对人们的生命安全和社会经济造成了严重危害。致命鹅膏所含肽类毒素有很强的毒性,它在分子生物学、医学及药学等许多方面有着良好的发展前景。目前关于致命鹅膏的研究仅在系统分类、菌丝分离培养及毒素检测方面有少量报道,而对毒素的生物活性及其编码基因的研究尚未开展。因此,本文从肽类毒素的检测、分离纯化、结构鉴定、抗肿瘤活性以及毒素相关编码基因等方面对致命鹅膏菌进行了系统的研究,为中毒患者的有效救治及毒素的开发利用提供相关科学依据。内容和结果如下:
⑴系统开展了致命鹅膏子实体肽类毒素的分析检测。采用HPLC法检测致命鹅膏子实体毒素粗提液,结果表明其粗毒素约有10个较明显的毒素物质洗脱峰,其中2个未知毒素峰为本研究首次检测到。主要毒素α—鹅膏毒肽的含量存在明显的个体差异,浓度范围为1336—3627μg/g干重。本文首次揭示了致命鹅膏子实体不同生长阶段的毒素含量变化规律,α—鹅膏毒肽含量在子实体生长旺盛期最高,其次是菌蕾期,成熟衰老期最低。在致命鹅膏生长过程中,毒素含量变化呈正态分布规律,但与分布地无明显相关性。
⑵分离纯化了致命鹅膏的肽类毒素并进行结构解析。采用HPLC方法对致命鹅膏毒素进行了分离纯化,获得了8个纯的毒素化合物。通过环肽检测、紫外光谱图、质谱及核磁共振谱等多种技术对毒素化合物进行了结构鉴定。结果表明,致命鹅膏子实体中含有α—鹅膏毒肽、β—鹅膏毒肽、三羟鹅膏毒肽酰胺、羧基一羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽和脱氧二羟毒伞素。其中前3种属于鹅膏毒肽类毒素,最后1种是毒伞毒肽类毒素,其他3种为鬼笔毒肽毒素。
⑶探讨了致命鹅膏肽类毒素的体外抗肿瘤活性。采用MTT法对致命鹅膏毒素粗提液及其分离纯化的8个毒素化合物进行了体外抗肿瘤活性研究。结果表明,毒素粗提液对人宫颈癌Hela细胞具有极强的增殖抑制作用,并表现为明显的时间和剂量依赖性,其抑制率的IC50为1.3—2.6μg/mL。同时粗毒素对肿瘤细胞的毒害作用起效快,当其中的α—鹅膏毒肽剂量为2.6μg/mL时,处理24小时,即有30%的Hela细胞死亡。它的最高抑制率可达90%,抑制效果明显高于广谱抗肿瘤药物—5—氟脲嘧啶。8种纯毒素对Hela细胞和肝癌细胞株7402的生长抑制作用表明,α—鹅膏毒肽和β—鹅膏毒肽具有较强的抑制活性。这两种毒素浓度为100μg/mL,作用72小时,抑制率达60%以上,与抗肿瘤药5—氟脲嘧啶的抑制效果相近,但在相同条件下对肝正常细胞L02的增殖抑制作用约为5—氟脲嘧啶的50%。其他6种毒素对肿瘤细胞Hela和7402,以及肝正常细胞L02的抑制作用相对较低。
⑷研究了致命鹅膏等东亚特有鹅膏菌的肽类毒素编码基因。采用鹅膏毒素基因扩增的简并引物对东亚4种特有毒鹅膏菌的cDNA进行扩增,共获得了8个毒素相关的编码基因,并推测了其编码的氨基酸序列。序列分析表明,这些基因编码的毒素相关蛋白氨基酸序列存在共同特征:毒素相关蛋白由32—35个氨基酸组成,所有氨基酸序列上、下游区域是相对保守的,其中上游为10个氨基酸,下游为15—17个氨基酸,中间是7—10个氨基酸组成的毒素高变区,该区的前一个氨基酸与结尾的氨基酸均为脯氨酸。