【摘 要】
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蒂巴因（Thebaine,TBN）是鸦片罂粟（Papaversomniferum）苄基异喹啉生物碱代谢途径中合成麻醉止痛剂吗啡和可待因的关键成分。它也是很多半合成药物的原料,在制药行业的需求量巨大。来源于鸦片罂粟乳胶的蒂巴因合成酶（THS2）可以将（7S）-沙丁胺醇-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因,并且消除自发反应产生的不稳定羟化副产物。本论文将THS2在大肠杆菌中表达、纯化,获得高纯度蛋白并培养蛋白
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蒂巴因（Thebaine,TBN）是鸦片罂粟（Papaversomniferum）苄基异喹啉生物碱代谢途径中合成麻醉止痛剂吗啡和可待因的关键成分。它也是很多半合成药物的原料,在制药行业的需求量巨大。来源于鸦片罂粟乳胶的蒂巴因合成酶（THS2）可以将（7S）-沙丁胺醇-7-O-乙酸酯转化为蒂巴因,并且消除自发反应产生的不稳定羟化副产物。本论文将THS2在大肠杆菌中表达、纯化,获得高纯度蛋白并培养蛋白质晶体。利用X-射线衍射技术收集数据,以人参主要乳胶蛋白（PDB:4REJ）为模板,采用分子取代法（MR）解析了分辨率为1.95 ?的晶体结构,并利用晶体浸泡产物的方法得到THS2与蒂巴因的复合体结构。THS2的结构遵循典型的Betv1折叠方式,即三个α-螺旋包裹七个反平行β-折叠组成一个三角构型。该蛋白每个不对称单元中有四个单体,形成两个同型二聚体。THS2-TBN复合体结构中,酶的许多氨基酸与蒂巴因的距离较近,其中W63侧链在蒂巴因C7的环己二烯附近,两者形成“T”字形构象,S74靠近氮原子,H89靠近C6的氧原子,T105的侧链羟基与蒂巴因氢呋喃环上的氧原子相邻。为了进一步探究蒂巴因的合成机理,本实验将底物（7S）-沙丁胺醇-7-O-乙酸酯对接到THS2中并进行分析。对接结果显示底物主要通过疏水相互作用结合到酶的中央疏水性口袋。由此推断蒂巴因的合成机制为:THS2的H89残基夺取T105侧链上的质子,然后使C4侧链羟基去质子化形成酚酸根阴离子,它作为亲核试剂攻击C5原子并触发SN2’置换,从而生成蒂巴因。本研究成功解析了 THS2及其复合体的晶体结构,并推测了蒂巴因的合成机制,为以后定向改造此合成酶提供重要的依据,对促进蒂巴因的生物合成具有重要作用。
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