重症肌无力（MG）是一种乙酰胆碱受体抗体（AChRAbs）介导、细胞免疫依赖、补体参与的自身免疫性疾病。神经肌肉接头处（NMJ）突触后膜的乙酰胆碱受体（AChR）受到自身抗体AChRAbs攻击，通过以下三种机制破坏突触后膜的生理结构和导致有效AChR数量减少：1.激活补体系统溶解、破坏肌膜；2.二价抗体的抗原调变作用（AM）加速AChR内化降解；3.少部分封闭AChR作用位点。突触后膜的破坏和AChR的减少引起终板电位（EPP）降低，NMJ处化学-电冲动脱偶联，神经电冲动无法到达效应器官，表现为肌肉无力。尽管MG突触后膜的破坏是由自身抗体AChRAbs介导的，然而自身抗体的产生还要依赖于CD4+的T细胞对B细胞的辅助才得以完成。抗体靶向补体调节因子的MG治疗策略可以在MG发病的效应阶段特异性减轻补体攻击引发的突触后膜损伤，而且单价抗体还会对AChR起到保护作用，使其免受致病的二价抗体交联内化，是一种潜在的MG治疗策略。　　实验目的是筛选出对乙酰胆碱受体AChR有较高亲和力的单链抗体scFv，并将其通过连接序列(G4S1)3与促衰变因子（DAF）在基因水平偶联。　　用原核表达系统表达融合蛋白scFv-DAF，经过亲和层析纯化，包涵体复性后得到正确折叠的可溶性scFv-DAF。并在分子和细胞水平检测scFv-DAF是否保留了两个组分scFv和DAF的功能。　　实验采用原核表达系统的载体pET16b和宿主菌BL21(DE3)pLysS来表达单链抗体scFv1929和scFv1956，并通过重组表达蛋白所携带的His标签，用Ni2+亲和层析柱纯化蛋白，梯度透析法重折叠包涵体。用SDS-PAGE和Western-Blot来检测重组表达蛋白的纯度、分子量大小和抗原性。用包被不同浓度抗原，人乙酰胆碱受体α亚单位1-210位氨基酸（hAChRα1-210）的ELISA法比较相同摩尔浓度的两株单链抗体scFv1929和scFv1956对乙酰胆碱受体AChR的结合力。并选出结合力较高的一株通过连接序列(G4S1)3与促衰变因子DAF用PCR的方法偶联。将测序正确scFv-DAF的结构基因克隆到载体pET16b中，按上述单链抗体的表达方案得到正确折叠的scFv-DAF。随后对scFv-DAF各组分的功能进行检测：首先用ELISA法比较相同摩尔浓度的scFv与scFv-DAF结合乙酰胆碱受体能力的差别；其次用绵羊红细胞的溶血保护实验来检验与DAF相比，scFv-DAF在经典途径补体活化过程中对致敏绵羊红细胞溶血的保护作用；最后用TE671细胞的补体攻击保护实验来阐明scFv-DAF能否用scFv将融合蛋白带到TE671细胞表面并与AChR特异性结合的同时发挥DAF抑制补体活化的功能，减少补体攻击引起的C3沉积。　　实验结果显示，表达纯化重折叠后的单链抗体scFv1956在不同浓度条件下对hAChRα1-210的结合力均优于scFv1929，因此选择scFv1956作为与DAF融合的靶向抗体。测序结果证实scFv1956与DAF借由(G4S1)3连接的融合蛋白结构基因碱基序列正确，无突变或框移。将scFv-DAF成功克隆到原核表达载体中表达、纯化并复性，得到可溶性scFv-DAF。SDS-PAGE和Western-Blot检测证实scFv-DAF的大小和抗原性与预期相符，说明融合蛋白折叠正确。体外分子水平实验证实scFv-DAF分别保留了scFv1956与AChR的结合力和DAF对经典途径补体活化的抑制作用。最后在TE671的补体攻击保护实验中scFv-DAF显示出功能性双分子的作用，不仅与TE671细胞表面的AChR结合，而且在数量和程度上均减轻补体攻击引起的细胞表面C3沉积。　　综上所述，实验筛选出有较高AChR结合能力的单链抗体scFv1956，并成功将其与DAF在基因水平偶联。用原核表达系统对融合蛋白进行了表达纯化和重折叠，得到可溶性scFv-DAF。融合蛋白scFv-DAF不仅在分子水平保留了特异性结合AChR和补体抑制的活性，而且在细胞水平成功将DAF靶向到AChR处，并抑制了经典途径补体活化。融合蛋白scFv-DAF的成功构建、表达及其功能鉴定，为下一步在实验性自身免疫重症肌无力（EAMG）动物水平验证抗体靶向补体调节因子这一MG治疗策略奠定了基础。