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目的:肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,尽管目前针对癌症治疗有手术、化疗、放疗和生物治疗等多种手段,但肺癌患者总的存活率仍然为所有恶性肿瘤中最低。造成肺癌患者死亡的最主要原因是肿瘤转移。近年来,研究显示,肿瘤酸性微环境作为所有实体瘤共同的理化性质,它在肿瘤进展中扮演着驱动者角色。在癌组织中,肿瘤酸性微环境具有上调肿瘤细胞恶性行为、激活肿瘤细胞外基质降解和血管生成等多重作用,进而促进肿瘤侵袭和转移,是介导肿瘤恶化的重要因素。然而,有关肿瘤酸性微环境介导癌症恶化的生物分子机制,目前仍然不清晰,这在一定程度上限制了肿瘤酸性微环境在肿瘤防治中的应用。TGF-β2是肺癌中转化生长因子的主要存在亚型之一,它能激活TGF-β信号通路,诱导肿瘤细胞表皮间充质转换,增强肿瘤细胞侵袭迁移,是介导肿瘤转移信号通路中的明星分子。miRNA作为一种非编码小RNA,其在生物体的表观遗传调控中意义非凡,生物体约30%基因的转录后修饰至少受一条miRNA调控。研究显示,miR-7能够靶向EGFR、IGFR和RELA等多个靶基因从而抑制肿瘤的进展,是一个重要的抑癌miRNA。开发miRNA药物,在未来肿瘤治疗中具有巨大的临床应用价值。本课题中,我们利用先前研究构建的酸性培养基体系模拟体内肿瘤酸性微环境的方式,建立酸性微环境体外细胞模型,阐明了肿瘤酸性微环境促进非小细胞肺癌转移的一种重要分子机制。方法:1.采用Transwell实验,探讨酸性微环境（记为pH6.6,为我们构建的体外酸性培养基）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞侵袭和迁移能力的影响。使用Western blot实验,检测pH6.6处理后非小细胞肺癌细胞表皮标志物E-cadherin和间充质标志物N-cadherin、Vimentin的表达变化,考察酸性微环境对非小细胞肺癌细胞表皮间充质转换（EMT）的影响。2.运用RNA-seq和miRNA-seq技术,分别检测pH6.6处理A549细胞后mRNA和miRNA的表达水平变化;并利用TargetScan7.2、Starbase2.0和miRDB数据库,结合生物信息学预测和分析手段,筛选酸性微环境调控NSCLC细胞转移的可能分子机制。其中,mRNA和miRNA定量使用qPCR方法。3.使用 TGFBRI 抑制剂 SB431542 或 TGF-β2 拮抗抗体 anti-TGFB2,抑制 TGF-β2/Smad通路的激活,分别采用Transwell和Western blot方法考察pH6.6诱导NSCLC细胞侵袭、迁移和EMT转化的改变。4.转染miR-7 mimic后,采用Transwell法,考察过表达miR-7对酸性微环境诱导的NSCLC细胞侵袭迁移的影响;转染miR-7 inhibitor后,采用Transwell法,考察抑制miR-7后NSCLC细胞侵袭迁移的改变。5.利用TargetScan7.2数据库预测miR-7与TGF-β2 3’ UTR区的结合位点,根据两者在预测位点的结合序列分别构建野生型和突变型质粒。采用双荧光素酶报告基因和RNA-RNA pulldown实验方法,验证miR-7和TGF-β2之间的直接靶相关性。6.细胞转染miR-7 inhibitor后加入anti-TGFB2（TGF-β 2拮抗抗体）共培养,或转染miR-7 mimic的同时过表达 TGF-β 2（pcDNA-TGFB2）;采用 Transwell 法,考察NSCLC细胞侵袭迁移的改变。结果:1.酸性微环境促进非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移和EMT转化pH6.6处理A549和H1975细胞后,Transwell结果显示,pH6.6处理组细胞较正常处理组（pH7.4）的侵袭迁移细胞数明显增多;而pH6.6处理过的细胞更换pH7.4培养基继续培养2天后,其侵袭迁移细胞数较pH6.6处理组明显减少。Western blot结果显示,与pH7.4组细胞相比,pH6.6明显下调非小细胞肺癌细胞表皮标志物E-cadherin蛋白的表达,上调间充质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表达,同样该过程可被pH7.4逆转。由此可见,酸性微环境能够增强NSCLC细胞转移能力、诱导其EMT转化。2.酸性微环境通过激活TGF-β2/Smad信号通路促进非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移和EMT转化pH6.6处理A549和H1975细胞后,与pH7.4组细胞相比,TGF-β2蛋白表达水平上调,同时其下游Smad2/3蛋白磷酸化水平升高,预示酸性微环境能激活NSCLC细胞中的TGF-β2/Smad信号通路。然而,分别使用TGFBRI抑制剂SB431542或TGF-β2拮抗抗体anti-TGFB2共培养,pH6.6诱导的TGF-β2/Smad信号通路激活被抑制,并明显逆转pH6.6诱导的非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移和EMT转化。3.酸性微环境通过下调miR-7的表达促进非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移采用 TargetScan7.2、Starbase2.0 和 miRDB 数据库预测调控TGF-β2翻译的miRNAs,并与A549细胞经pH6.6处理4天后的miRNA-seq测序结果进行交集分析,结果发现:pH6.6处理A549细胞后,TGF-β2上游潜在调控分子miR-7表达显著下调;且转染miR-7 mimic,可明显逆转pH6.6诱导的非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移数增多;而转染miR-7 inhibitor,可诱导非小细胞肺癌细胞产生类似pH6.6刺激诱导的细胞侵袭、迁移数增多。4.TGF-β2是miR-7下游的直接靶标双荧光素酶报告基因结果显示,miR-7抑制TGF-β2的3’UTR野生型质粒荧光值表达,而对突变型质粒的荧光值表达抑制作用明显低于野生型质粒,此外,RNA-RNA pulldown结果显示,正义链sense对miR-7的回收率明显高于反义链anti-sense。这些结果表明TGF-β2是miR-7下游的直接靶标。5.miR-7通过靶向TGF-β2/Smad信号通路调控非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移与 inhibitor NC 组相比,miR-7 inhibitor 转染组中 NSCLC 细胞的 TGF-β2 和p-Smad2/3蛋白水平明显升高,并且细胞侵袭迁移数明显增多;而加入anti-TGFB2共培养后,anti-TGFB2能够逆转miR-7 inhibitor诱导的TGF-β2、p-Smad2/3蛋白上调以及侵袭转移细胞数增多。相反,与mimic NC+pcDNA（pcDNA指空载质粒）组相比,miR-7 mimic+pcDNA转染组中NSCLC细胞的侵袭迁移细胞数明显减少,而在转染miR-7 mimic的细胞中同时过表达TGFB2（pcDNA-TGFB2）后,miR-7 mimic介导的细胞侵袭迁移减少被逆转。结论:综上所述,本研究得出结论:酸性微环境通过下调miR-7的表达,上调其靶蛋白TGF-β2的表达,激活下游Smad信号通路,进而促进非小细胞肺癌转移。本研究阐明了肿瘤酸性微环境介导肺癌转移的一种重要的分子机制,且调控miR-7/TGF-β2信号轴有望成为抑制肺癌转移的有效策略之一。