论文部分内容阅读
原发性肝癌包括肝细胞癌、肝内胆管癌、混合性肝癌及-一些少见类型。甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)是肝癌细胞特异性表达的蛋白质,一般肝癌患者会出现AFP基因高表达的特征,但临床上有一部分肝癌病人血清AFP含量小于等于20ng/ml,这部分病人被定义为AFP阴性肝癌。原发性肝内胆管癌(ICC)是仅次于肝细胞癌(HCC)的肝脏原发性肿瘤,它是不同于肝外胆管癌及肝门部胆管癌的一种独立的疾病,占肝脏原发恶性肿瘤的5-20%。第一部分研究工作中,我们为了鉴定原发性肝细胞肝癌和原发性肝内胆管癌内在遗传学分子机制,我们采用先进的外显子捕获测序技术分析了21例AFP阴性肝细胞癌病人的癌组织及对应癌旁肝组织样本、12例原发性肝内胆管癌(ICC)病人的癌组织及对应癌旁肝组织样本的全外显子序列。利用外显子捕获芯片富集病人样本基因组DNA上的蛋白编码序列,采用SOLiD测序平台分析捕获的样本序列。通过对高通量测序数据设定不同的过滤分析参数,鉴定得到高、中、低可信度的候选突变位点。为了验证这些候选突变位点的正确性,我们选择了部分候选突变位点,通过PCR-Sanger的常规测序方法对候选突变位点进行验证,从而鉴定AFP阴性肝细胞癌和原发性肝内胆管癌中的突变基因。PCR-Sanger测序结果发现AFP阴性肝细胞癌中高可信度的候选突变基因位点的正确率是55.6%,低可信度的候选突变基因的验证率为30.8%,该结果说明了高通量测序技术在鉴定肝癌体细胞突变位点的可行性。第二部分研究工作中,为了分析比较AFP阳性、阴性肝癌之间的分化特征以及已知肝癌致病基因TP53的突变情况,我们分析了62例原发性肝细胞癌患者样本中TP53基因编码序列及剪接位点序列的突变情况。结果发现30%的病人中存在TP53基因的突变,另外我们也通过定量PCR技术检测了肝细胞分化标志物基因AFP.DLK1、EPCAM.白蛋白ALB、角蛋白18(CK-18)基因、角蛋白19(CK-19)基因以及胚胎干细胞相关的转录因子NANOG、OCT4、SOX2基因在原发性肝癌组织样本中的表达特征。实验结果表明肝癌干细胞标志物DLK1、EPCAM基因在血清AFP阴性、阳性病例中表达具有统计学差异,提示AFP阳性的肝癌细胞分化程度低,具有肝癌干细胞标志物DLK1、EPCAM的表达。此外对胚胎干细胞调控转录因子在肝癌病例中的表达进行分析发现多能干细胞转录调控因子OCT4和NANOG在这些样本中表达存在高度相关。