大米蛋白与阿魏酸交联对阿魏酸消化吸收的影响

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大米蛋白(Rice protein,RP)是一种优质的植物蛋白,具有高营养性和低过敏性等特点,占大米总量的8%左右。虽然大米蛋白含量相对较低,但由于我国大米的播种面积与产量巨大,因此我国的大米蛋白资源相对充足。阿魏酸(Ferulic acid,FA)是普遍存在于植物当中的一种酚酸,具有较强的抗氧化、抗菌、降胆固醇和抗癌等生理活性,广泛存在于中药材和食品原料中,如当归、川芎、阿魏、咖啡、麦麸和米糠等。阿魏酸和大部分酚类化合物一样,在体外容易被氧化降解。前期的研究表明,大米蛋白的交联能够增强阿魏酸在体外的氧化稳定性,但其对阿魏酸在胃肠道消化中的释放及在体内的吸收还未可知。因此,本文以阿魏酸为主要研究对象,通过漆酶(Laccase,LAC)催化与大米蛋白交联,利用体外模拟胃肠道消化和Caco-2(Human colon adenocarcinoma cell line)细胞模型,研究其对阿魏酸消化吸收的影响,以及阿魏酸在体外模拟消化前后的抗氧化能力。主要结果如下:  1、阿魏酸/大米蛋白样品(RF)中阿魏酸相对含量下降为63.23%~82.63%,阿魏酸/大米蛋白/漆酶样品(RFL)中阿魏酸相对含量降低为4.49%~40.63%。口腔消化后,阿魏酸相对含量下降,大米蛋白/阿魏酸样品的阿魏酸相对含量有所增加或不变,大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的阿魏酸相对含量增加为4.99%~51.99%。胃消化后,大米蛋白/阿魏酸样品和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的阿魏酸相对含量均增加,这是因为模拟胃液的酸性环境以及胃蛋白酶的水解作用使得阿魏酸从大米蛋白/阿魏酸复合物和大米蛋白/阿魏酸/漆酶复合物中释放出来。肠消化后,阿魏酸、大米蛋白/阿魏酸样品和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的阿魏酸相对含量较为稳定。  2、随着阿魏酸浓度的增加,阿魏酸、大米蛋白/阿魏酸样品和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力均逐渐增加,且大米蛋白/阿魏酸样品>阿魏酸>大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品>大米蛋白;结果还表明,大米蛋白能够相对降低阿魏酸的DPPH·清除能力,提高其稳定性。体外消化后,大米蛋白、阿魏酸和空白对照(CK)的DPPH·清除能力之间均无显著性差异(p<0.05);但大米蛋白/阿魏酸样品和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的DPPH·清除能力均显著大于空白对照(p<0.05)。在体外消化过程中,空白对照、大米蛋白、阿魏酸、大米蛋白/阿魏酸样品和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的ABTS+·清除能力均逐渐增加。肠消化后,大米蛋白、阿魏酸、大米蛋白/阿魏酸样品和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的ABTS+·清除能力均显著大于空白对照(p<0.05),且大米蛋白/阿魏酸样品>阿魏酸>大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品>大米蛋白。  3、Caco-2细胞培养21天后,细胞间紧密排列、无缝隙;跨细胞转运标记物普萘洛尔的表观渗透系数(Apparent permeability coefficient,Ppp)为(2.77±0.31)×10-5cm/s,与参考值2.75×10-5cm/s接近。细胞培养18天后,跨膜电阻值(TEER)维持在370Ω/cm2左右。随着培养天数的增加,Caco-2细胞肠腔侧(Apical lateral,AP)和基底侧(Basal lateral,BL)两侧的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatease,AKP)活力差呈线性增加的趋势;且与培养17天后相比,Caco-2细胞培养21天后AP、BL两侧的碱性磷酸酶活力均显著增加(n=4,p<0.05)。因此,本实验室条件下建立的Caco-2细胞模型成功,可以作为肠吸收模型,用来研究阿魏酸的肠吸收转运情况。HPLC分析表明阿魏酸在37℃、5%CO2(相对湿度95%)的条件下比较稳定。0~2000μg/mL范围内的阿魏酸,其与Caco-2细胞培养2h后细胞存活率均大于90%。  4、阿魏酸、阿魏酸肠消化液(F-D)、大米蛋白/阿魏酸样品的肠消化液(RF-D)和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的肠消化液(RFL-D)的阿魏酸累积转运量(Qr)均随细胞吸收转运时间的延长而线性增加,从大到小依次是:阿魏酸肠消化液=大米蛋白/阿魏酸样品的肠消化液>阿魏酸>大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的肠消化液,说明胃肠道消化和大米蛋白有利于阿魏酸的吸收转运。阿魏酸浓度越大,阿魏酸、阿魏酸肠消化液和大米蛋白/阿魏酸样品的肠消化液的阿魏酸累积转运量越大。低浓度时阿魏酸、阿魏酸肠消化液、大米蛋白/阿魏酸样品的肠消化液和大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的肠消化液中阿魏酸的Papp值显著高于高浓度时的Papp值(p<0.05)。120min时,阿魏酸的Papp值显著低于阿魏酸肠消化液和大米蛋白/阿魏酸样品的肠消化液的Papp值,但显著高于大米蛋白/阿魏酸/漆酶样品的肠消化液的Papp值(p<0.05);同时,阿魏酸肠消化液和大米蛋白/阿魏酸样品的肠消化液的Papp值之间无显著性差异(p<0.05)。表明阿魏酸和大米蛋白/阿魏酸样品经过消化以后更容易被Caco-2细胞单层吸收转运。
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