第一部分B7-H4在小鼠食管癌前病变进程中的表达目的:食管鳞状细胞癌(esohaphageal squamous cell carcinoma,ESCC)是严重威胁人类生命及健康的癌症之一。由于大部分患者在确诊时已是中晚期,没有显著有效的治疗措施,ESCC的预后一直较差,5年生存率约为20%。食管癌前病变是正常食管向ESCC转变过程中的一种组织病理异常。如果接受恰当的诊断和治疗,食管癌前病变预后较好,5年生存率可超过90%。因此,预防和治疗食管癌前病变是降低ESCC发病率和致死率的重要措施。协同刺激分子B7-H4是B7家族重要成员,在多种肿瘤组织中高表达,并与预后呈负相关。为了研究食管癌前病变的发病机制,探讨B7-H4在食管癌前病变进程中的作用,本文拟采用4NQO饮水法诱导建立小鼠食管癌前病变模型,观察食管癌前病变自然进程中的组织病理改变,研究B7-H4在小鼠食管癌前病变形成过程中的表达变化,及与肿瘤微环境中的相关淋巴细胞和细胞因子表达的关系,为评价其能否成为食管癌前病变诊断和治疗的新靶标奠定基础。方法:1通过4NQO饮水法诱导小鼠食管癌前病变模型,观察病变过程中小鼠一般状态及体重变化,并通过HE染色法评价食管癌前病变自然进程中食管组织的病理改变。2通过免疫组织化学染色技术评价小鼠食管癌前病变自然进程中B7-H4在食管上皮细胞的表达,以及CD4+T、CD8+T、CD11b+巨噬细胞在食管上皮组织的浸润,并分析B7-H4表达与淋巴细胞浸润之间的相关性。3通过qPCR、Western blot和ELISA方法检测食管癌前病变进程中B7-H4、IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ、total STAT3和p-STAT3的表达,并分析其相关性。4通过ELISA和Western blot方法检测小鼠食管癌前病变进程中血清b7-h4(sb7-h4)和鳞状细胞癌抗原-2(scca-2)的表达,并分析其与病变程度的相关性。结果:1小鼠体重变化诱癌前,小鼠状态良好。随着诱癌时间的延长,对照组动物状态良好,饮食饮水正常,4nqo小鼠饮食饮水逐渐减少,一般状态逐渐变差。另外,对照组小鼠体重增长正常。而与对照组相比,4nqo诱癌组动物体重增长缓慢,特别是在17周之后,4nqo诱癌组雌性和雄性动物体重均逐渐降低,而且分别显著低于对照组雌性和雄性动物体重。2小鼠食管组织病变特点从诱癌16周至28周,4nqo诱癌组小鼠食管组织出现肉眼可见的不同程度的病理改变,包括上皮组织增厚,表面粗糙、凹凸不平,及肿块。随着诱癌时间的延长,病变程度逐渐增加。3he染色评价食管组织病理改变在整个诱癌过程中,4nqo诱癌小鼠食管组织经历了从正常食管、低级别上皮内瘤变(lgin)至高级别上皮内瘤变(hgin)的病理改变过程。小鼠食管组织病理改变与诱癌时间呈显著正相关,χ2=33.5476,p<0.0001。另外,kruskal-wallis分析结果表明,雌雄小鼠食管组织病理改变无显著差异,p>0.05。4免疫组化检测b7-h4及淋巴细胞表达变化b7-h4表达于上皮细胞的胞浆和胞膜。根据评分结果,22例正常食管组织只有2例b7-h4高表达(9.1%)。食管癌前病变组织中,27例lgin食管组织有11例b7-h4高表达(40.7%),21例hgin食管组织有17例b7-h4高表达(81.0%)。spearman相关性分析表明,b7-h4表达与病理级别呈显著正相关(p<0.0001),而与小鼠性别无显著相关性(p=0.2959)。cd4、cd8和cd11b分别是cd4+t,cd8+t和巨噬细胞表面表达的膜分子。三种淋巴细胞主要浸润于食管上皮组织的粘膜下层,而在粘膜层浸润较少。另外,b7-h4表达与cd11b巨噬细胞在粘膜下层的浸润呈显著正相关(p=0.0002),而与cd4+t和cd8+t浸润无显著相关性(p=0.8507,p=0.3166)。5qpcr检测b7-h4及相关细胞因子和stat3表达与对照组相比,随着诱癌时间的延长,4nqo小鼠食管组织b7-h4、il-6、il-10、tgf-β基因表达逐渐提高,特别是26周和28周,上述基因表达显著提高,且均具有显著性差异。另外,通过spearman相关性分析,b7-h4与il-6(r=0.5952,p<0.0001),il-10(r=0.6561,p<0.0001),tgf-β(r=0.6586,p<0.0001)呈显著正相关。然而,ifn-γ和stat3基因表达升高不明显。6westernblot和elisa法检测b7-h4与相关蛋白表达与对照组比较,随着诱癌时间的延长,4nqo诱癌组小鼠食管组织b7-h4和il-6蛋白表达逐渐提高,特别是26周和28周,两种蛋白提高具有显著性差异,p<0.05,p<0.01。另外,与对照组相比,4nqo诱癌组小鼠食管组织28周p-stat3表达显著提高,p<0.01。另一方面,在整个诱癌过程中,b7-h4的表达与il-6或p-stat3的表达呈显著正相关,(r=0.6145,p<0.0001;r=0.6180,p<0.0001)。总之,结果表明,在小鼠食管癌前病变形成的过程中,b7-h4表达与il-6/stat3信号通路活化呈正相关。7westernblot和elisa法检测sb7-h4及scca-2蛋白表达与正常小鼠相比,hgin小鼠血清中sb7-h4及scca-2蛋白浓度显著提高,p<0.05,p<0.05。结果提示,sb7-h4与scca-2蛋白相似,可能成为食管癌及癌前病变潜在的肿瘤标志物。第二部分b7-h4活化il-6/stat3通路并促进食管鳞状细胞癌细胞增殖目的:为了进一步研究b7-h4参与食管癌前病变形成的作用机制,以及其表达改变对il-6/stat3信号通路的作用,本部分内容研究了b7-h4对eca109、te1和te13三种escc细胞生物学功能的影响,以及其与il-6/stat3信号通路活化之间的关系。方法:1mts细胞增殖实验收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,接种于96孔板,在接种后的0h、24h、48h、72h,每孔加入20μlmts染色液,用酶标仪在490nm测定吸光度值,检测细胞的增殖率。2克隆形成实验收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,接种入3cm直径的培养皿,常规培养12天,计数细胞克隆数。3流式细胞术检测细胞周期收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,通过pi染色,用流式细胞仪检测dna含量分布,分析细胞周期特点。4流式细胞仪检测细胞凋亡收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,通过annexin-Ⅴ和7-aad染色,在流式细胞仪上检测细胞凋亡特点。5qpcr和westernblot、elisa法检测b7-h4及相关分子表达收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,通过qpcr和westernblot方法检测b7-h4、il-6、stat3、p-stat3、jak2、p-jak2、bcl-2、bax和survivin的表达。6免疫荧光染色和westernblot检测totalstat3和p-stat3在胞浆和胞核的定位收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,通过免疫荧光染色技术观察totalstat3和p-stat3在细胞浆和细胞核的分布。收集空白对照和敲低b7-h4的escc细胞,分别提取细胞浆和细胞核的蛋白,通过westernblot方法检测totalstat3和p-stat3在细胞浆和细胞核的表达。7ag490对b7-h4沉默抑制il-6分泌的作用将40μmag490(jak2/stat3抑制剂)处理的细胞,转染controlshrna或b7-h4shrna,48h后收集上清液,通过elisa方法检测细胞上清液il-6浓度。8tocilizumab对b7-h4沉默抑制jak2/stat3活化的作用将200ng/mltocilizumab(il-6受体阻断剂)处理的细胞转染controlshrna或b7-h4shrna,48h后收集细胞,通过westernblot方法检测totaljak2、p-jak2、totalstat3、p-stat3的蛋白表达。结果:1b7-h4在escc细胞高表达eca109、te1和te13均为escc细胞。其中,eca109和te13为高分化,te13为低分化。b7-h4在人正常食管组织几乎不表达。与正常食管组织相比,b7-h4在eca109、te1和te13三种细胞均高表达,而且,b7-h4在eca109、te1和te13表达水平相似,无显著性差异,p>0.05。2b7-h4沉默抑制细胞增殖及克隆形成mts实验结果表明,与controlshrna处理组相比,b7-h4shrna处理的eca109、te1和te13细胞在接种后48h和72h增殖率都显著降低。克隆形成实验结果显示,与controlshrna处理细胞相比,b7-h4沉默可显著降低eca109、te1和te13细胞的克隆数,p值分别为<0.05,<0.001,<0.001。3b7-h4对escc细胞周期的影响与空白对照细胞相比,b7-h4shrna处理的eca109、te1和te13细胞g1期比例显著提高,p值均为<0.05,而s期和g2期比例有一定程度的降低,但无显著性差异,p值均>0.05。4b7-h4对escc细胞凋亡的影响与空白对照相比,b7-h4敲低的eca109、te1和te13细胞总凋亡率显著提高,p<0.001,<0.01,和<0.05。另外,与空白对照相比,b7-h4敲低的细胞早期凋亡和晚期凋亡率也分别有一定程度的提高,p<0.05或p<0.01。5b7-h4对escc细胞凋亡相关分子表达的影响与空白对照相比,b7-h4低表达的escc细胞表现为显著的凋亡抑制分子bcl-2和survivin表达下调,以及凋亡促进分子bax的表达上调,p<0.01或p<0.001。6b7-h4对escc细胞il-6分泌的影响与空白对照相比,b7-h4敲低的eca109、te1和te13细胞上清液il-6浓度显著降低,p<0.05,p<0.01,或p<0.01。7b7-h4对jak2、stat3活化的影响与空白对照相比,b7-h4敲低的eca109、te1和te13细胞总stat3的表达无显著差异,而p-stat3(stat3的活化形式)的表达显著降低,p均<0.001。另外,b7-h4沉默可显著降低eca109、te1和te13细胞p-jak2的表达,而对总jak2表达无影响,p<0.01,p<0.05,p<0.01。由此可知,b7-h4在jak2/stat3信号通路活化中起重要作用。8b7-h4对stat3和p-stat3核浆转位的影响b7-h4敲低后可显著降低p-stat3在eca109、te1和te13细胞核的表达(p<0.01,p<0.05,p<0.05),而对其在细胞浆的表达无显著影响,p均>0.05。另外,b7-h4敲低对总stat3在细胞浆及细胞核的表达均无显著影响,p均>0.05。9ag490阻断了b7-h4敲低对il-6分泌的抑制作用与空白对照细胞相比,b7-h4shrna处理的eca109、te1和te13细胞il-6分泌显著降低,p<0.01,p<0.01,p<0.001。而与controlshrna和ag490合用处理组相比,b7-h4shrna和ag490处理的eca109、te1和te13细胞il-6分泌无显著差异,p均>0.05。上述结果提示b7-h4敲低是通过抑制stat3的活化进而抑制il-6的分泌。10tocilizumab不能阻断b7-h4敲低对jak2/stat3活化的抑制作用与空白对照细胞相比,b7-h4shrna处理的te13细胞p-jak2和p-stat3表达显著降低,p<0.05,p<0.05。与controlshrna和tocilizumab单独处理组相比,b7-h4shrna与tocilizumab处理的te13细胞p-jak2和p-stat3表达也显著降低,p<0.05,p<0.05。结果提示无论是否存在il-6,b7-h4敲低均直接抑制了jak2/stat3的活化。第三部分il-6促进食管鳞状细胞癌细胞增殖及与b7-h4表达的关系目的:为了进一步阐明b7-h4促进il-6分泌是否是b7-h4促进escc细胞增殖的分子机制,以及b7-h4的表达是否受il-6的影响,本部分内容研究了il-6促进escc细胞增殖的作用及与b7-h4分子表达的关系。方法:1il-6对escc细胞增殖的影响收集eca109、te1和te13细胞,以4000个细胞/孔接种入96孔板,分别加入含0、10、20、40ng/mlil-6蛋白的培养基,通过mts实验检测细胞的增殖能力。2tocilizumab对escc细胞增殖的影响收集controlshrna和b7-h4shrna处理的eca109、te1和te13细胞,以4000个细胞/孔分别接种入96孔板,用含或不含tocilizumab(200ng/ml)培养基培养。通过mts和克隆形成实验检测细胞的增殖和克隆形成能力。3il-6对escc细胞b7-h4表达的影响收集eca109、te1和te13细胞,分别加入含或不含40ng/mlil-6蛋白的培养基孵育48h。收集细胞,通过westernblot方法检测b7-h4表达。4tocilizumab对escc细胞b7-h4表达的影响收集eca109、te1和te13细胞,以5×105细胞/孔接种入6孔板,分别加入含或不含200ng/ml人il-6受体阻断剂tocilizumab的培养基孵育48h。收集细胞,通过westernblot方法考察b7-h4表达。结果:1il-6不能促进escc细胞增殖与空白对照组相比,10、20和40ng/ml的il-6处理的eca109、te1和te13细胞增殖率无明显差异,p均>0.05。2tocilizumab抑制escc细胞增殖及克隆形成200ng/ml的tocilizumab可显著抑制eca109、te1和te13细胞增殖率和克隆数。3tocilizumab不能抑制b7-h4敲低的escc细胞增殖及克隆形成与b7-h4敲低单独处理的细胞相比,200ng/ml的tocilizumab对b7-h4敲低的eca109、te1和te13细胞增殖率和克隆数无显著影响,p均>0.05。4il-6不能诱导escc细胞b7-h4的表达40ng/mlil-6对eca109、te1和te13细胞b7-h4的表达无影响,p均>0.05。。5tocilizumab抑制escc细胞b7-h4的表达与正常escc细胞相比,tocilizumab可显著降低b7-h4在eca109、te1和te13细胞的表达,p分别为<0.05,<0.001和<0.01。结论:14nqo饮水法可成功诱导小鼠食管癌前病变的形成。2b7-h4参与并促进了il-6/stat3正反馈信号通路。b7-h4/il-6/stat3正反馈作用是促进escc细胞增殖和食管癌前病变形成的分子机制。